СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ИНТЕРФЕРОНА Российский патент 1999 года по МПК A61K38/21 A61K9/127 

Известны средства, помогающие повышению проницаемости клеток. Это липосомы. Однако липосомальные формы интерферона, изученные в эксперименте на животных (Eppstein D. A. 1982 г.; Мельников В.Р. с соавт., 1990) для медицинских целей не создавались и не применялись, α - интерферон (человеческих лейкоцитарный) представляет собой низкомолекулярный пептид, водорастворимый с молекулярной массой 17,5 КД, содержащий две дисульфидные связи (Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, 1987, с. 224-226).

При этом применяемый для лечения водный раствор интерферона лабилен и не защищен от действия протеаз, имеющихся в биологических жидкостях организма (Мельников В.Д., соавт., 1990).

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа приготовления липосомального лейкоцитарного α -интерферона и оценка его терапевтической эффективности в сравнении с нативными.

Наиболее близок к предлагаемому способу классический метод получения МЛЛ-везикул, описанный в информации: WO 91/01710, 21.02.91 г., КЛ⁶ A 61 A 37 K 37/66, учитывающий добавление к смеси липидов, включающей яичный лецитин, холестерин и фосфатидилсерин в молярном соотношении 2:1:0,33 антоксиданта альфа-токоферола в количестве 1%. Смесь растворяют в хлороформе и выпаривают из раствора под азотом. Липидную пленку ресуспендируют в фосфатном буфере при pH 7, содержащем человеческий рекомбинантный альфа-интерферон и альбумин, смесь озвучивают от 10' до 30' мин. и невключенный интерферон удаляют центрифугированием. Липосомы содержали 1,8 • 10⁷ МЕ на 1 мл.

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа интерферона и оценка его терапевтической эффективности в сравнении с нативным. Для достижения цели были использованы:
1. Официальный препарат лейкоцитарного человеческого интерферона - реаферон производства НПО "Иммунопрепарат" г. Уфа, разрешенный к применению в медицинской практике по ФС 42-247 ВС-91.

2. Липосомная основа, приготовленная нами из очищенных нами же отходов производства пищевых соевых растительных масел (схема 1).

3. Комплексная липосомальная форма препарата интерферона, изготовленная нами с учетом рекомендаций В.Р.Мельникова с соавт. (1990). Липосомальную основу готовили следующим образом: производили очистку сырого фосфолипидного концентрата - отхода при производстве пищевых масел на масложиркомбинатах. Очистку фосфолипидного коммерческого соевого концентрата производили с учетом рекомендаций Л. Д.Бергельсона (1981) путем многократной переэкстракции хлороформом, этанолом переосаждением охлажденным ацетоном по разработанной нами схеме 1 "Выделение, очистка и анализ липидного носителя для конструирования липосом из отходов производства пищевых соевых растительных масел".

Химический состав фосфолипидов очищенного соевого фосфолипидного концентрата приведен в табл. 1.

Экспериментальные исследования по использованию очищенного суммарного фосфолипидного носителя в медицине показали, что он нетоксичен, не обладает парогенными свойствами и хорошо усваивается организмом. Состав очищенного суммарного фосфолипидного концентрата имеет большее сродство к фракционному профилю внутренних органов - детоксикантов у человека - печени и почек, нежели состав фосфолипидов куриного желтка (табл. 2).

Таким образом, фосфолипидный носитель, приготовленный по нашей технологии можно считать более гомологичным для человека, нежели традиционно используемый яичный фосфолипид.

Препарат производственного интерферона подготавливали к использованию так: одну ампулу интерферона, содержащую 1 млн ME разводили таким образом в стерильном физрастворе, что концентрация составила от 1 млн МЕ до 250000 МЕ/см³. Использовали сразу же после приготовления.

Липосомальную форму интерферона готовили по следующей методике в два этапа.

I. , Первый этап. Смешивают 100 мг очищенных фосфолипидов сои в 10 мл CHCl₃ 20 мг холестерина (соотношение 5:1), v/v в р-ре хлороформа и 4 мг антиоксиданта альфа-токаферола в растворе этанола. Полученный раствор упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 35^o-40^oC до образования тонкой пленки холестерин /антиоксидант/ фосфолипид. Полученную пленку аэрируют в течение 1 часа с помощью азота для предотвращения окислительных процессов.

II. На втором этапе вводят свежеприготовленный интерферон в физрастворе от 1 млн МЕ до 250000 мг/см³, объемом от 1 до 5 см³. Содержимое колбы диспергируют и затем озвучивают в течение 10 минут трехкратно при 22 кГц при 10^oC. Суспензию липосом отделяют от невключенного интерферона центрифугированием при 10000 об/мин в течение 45 минут. Надосадочную жидкость сливают. Определяют в ней содержание невключенного интерферона спектрофотометрическим методом на приборе СФ-4 при рабочей длине 280 нм с использованием стандартной калибровочной кривой по интерферону.

Получают липосомный комплекс следующего состава, мг/мл
фосфолипиды - 20 мг
холестерин - 4 мг
антиоксидант - 2 мг
интерферон - 12,5 мг
физиологический р-р - до 3 мл;
соотношение компонентов 1:5:0,1:0,5.

При запредельных отношениях фосфолипидов/физраствор не достигается максимальной стабильности липосом, а при запредельных отношениях фосфолипиды/ интерферон увеличивается содержание интерферона невключенного.

Коэффициент включения интерферона 55-65%. Сравнительная эффективность включения интерферона в различные носители помещена в табл. 3.

Для безопасности применения липосомальный интерферон подвергали пастеризации при 40^oC последующим контролем возможного присутствия бактериальных примесей методом посева готового препарата на питательную среду, термостатирования посевов при комнатной температуре (+22^o, +25^oC) и в условиях термостата (+37^oC). При отсутствии роста в течение 5 суток (визуальный и стериомикроскопический контроль) препарат считался стерильным и готовым к применению.

Для терапевтического лечения в условиях гинекологического стационара центра по профилактике и лечению СПИДа было отобрано 60 женщин волонтеров, страдающих урогенетальным герпесом. Все они получали общепринятое лечение, согласно существующей инструкции, в том числе и местно интерферон, но в отличие от контрольной группы больных этим заболеванием, леченых нативным интерфероном, опытная группа женщин-волонтеров получала тот же препарат той же серии производства, но в липосомальной форме.

Оценку сравнительной эффективности проводили по 16-бальной системе, в которой учитывались субъективные ощущения - боль, зуд, гиперемия, отек, высыпания - везикулы и эрозии. Дополнительными критериями служили время начала признаков остановки патологического процесса, продолжительность острого периода, периода ремиссии, катамнестические сведения за время наблюдения - частоту обострений. При этом учитывался и экономический эффект: средняя стоимость койко-дня, применяемого интерферона, оборачиваемость коечного фонда и прочие медико-социальные и экономические признаки.

Результаты сравнительной оценки медико-социальной эффективности и экономической ценности предлагаемого способа представлены в табл. 4, 5.

Пример 1. Больная С., 32 лет, диагноз - рецидивирующий генитальный герпес. Заболела 5 лет назад после случайного полового контакта, перенесла острую форму инфекции в течение 3 недель, с лихорадкой, болезненностью, гиперемией, отеком, обширными высыпаниями на половых органах. Лечение - местное. После чего 6-8 раз в году появляются рецидивы генитального герпеса с менее выраженной симптоматикой, продолжающиеся 7-9 дней. В течение 6 месяцев получает иммунокоррегирующее, противовирусное лечение - ацикловиром, местное лечение - водным раствором интерферона, на фоне которого купирование местных симптомов происходит за 4-5 дней.

При применении липосомального интерферона симптомы купируются за 2-3 дня.

Пример 2. Больная Г. , 18 лет, диагноз - рецидивирующий генитальный герпес. Заболела 2 года назад после нетрадиционного полового контакта.

Перенесла острую форму инфекции, продолжающуюся 4 недели. После чего через 1-2 месяца возникают рецидивы заболевания до или после менструации. С течением времени высыпания становятся более болезненными, обширными, периоды обострений сопровождаются лихорадкой.

В течение 6 месяцев получает лечение - ацикловир, реадгерон, противогерпетический - глобулин, местно - водный раствор интерферона.

Купирование симптомов происходило за 4-5 дней; При использовании липосомального интерферона симптомы купировались за 1-2 дня.

Все больные отмечали хорошую переносимость препарата, его впитываемость кожей, слизистыми, отсутствие аллергических реакций.

Расчет ведется исходя из стоимости 1 ампулы 1,6 тыс. рублей. Расчет предотвращенного экономического ущерба в связи с затратами на лечение 100 больных.

Расчет сделан на основе Методической рекомендации ЦНИО НИУ 1 ММИ им. И. М.Сеченова, Москва, 1984 г.

Способ лечения Липосом. И.Ф.

1,6 • 5 • 10 = 900 тыс. рублей.

Способ лечения водным раствором интерферона
1,6 • 25 • 100 = 4 млн. руб.

Таким образом экономический эффект предлагаемого способа лечения определяется тем, что он обходится государству в 40 раз дешевле.

Как следует из приведенных данных экономический эффект применения липосомального препарата больше.

Все сказанное позволяет уменьшить лечебные дозы препарата в 5 раз. Препарат обладает направленным действием. Данный липосомальный комплекс интерферона привлекателен как средство доставки во внутриклеточную среду. Все это значительно повышает эффективность препарата и определяет его деятельное использование для лечения урогенитального герпеса и других инфекционных заболеваний.

На основании медико-социальной и экономических преимуществ предлагается следующая формула изобретения.

Изобретение относится к медицине и касается способа приготовления липосомального интерферона. Сущность изобретения заключается в смешивании липосомального носителя, приготовленного из отходов производства соевых пищевых растительных масел с холестерином и альфа-токоферолом, растворении в хлороформе, упаривании до образования тонкой пленки, продувании азота в течение 1 ч и добавлении интерферона, ультраозвучивании, диспергировании и пастеризации. Преимущество изобретения заключается в приготовлении липосомального интерферона с использованием липосомального носителя из отходов производства соевого масла, позволяющего повысить эффективность включения интерферона. 5 табл.

Способ приготовления липосомального интерферона, отличающийся тем, что в липосомальный носитель, приготовленный из отходов производства соевых пищевых растительных масел, имеющий следующий фракционный состав суммарных фосфолипидов, %:
Фосфатидилхолин - 32,0
Фосфатидилэтаноламин - 21,0
Фосфатидилсерин - 3,0
Фосфатидилинозин - 18,0
Фосфатидная кислота - 2,0
Фитогликолипиды - 15,0
Другие - 9,5
вводят холестерин в качестве антиоксиданта - альфа-токоферол, растворяют в хлороформе, упаривают до образования тонкой пленки, продувают азот в течение 1 ч и добавляют интерферон в физрастворе активностью 208 - 250 тысяч ME, диспергируют и после ультраозвучивания пастеризуют при 80^oC.