Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных Российский патент 2025 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится ветеринарии и ветеринарной медицине и может быть использовано для лечения и профилактики радиационных поражений организма, острой лучевой болезни, путем нейтрализации радиоиндуцированных токсических продуктов оксидативной модификации.

Одним из ключевых механизмов радиационных поражений организма является развитие лучевой токсемии («радиационный токсикоз»), сопровождающийся появлением и накоплением в организме токсических продуктов радиолиза (активных форм кислорода - АФК): синглетный кислород (¹О₂), супероксид анион - радикал (O₂) перекись водорода (Н₂О₂), и гидроксирадикал (НО¹) (Fridovich Superocide anio radicalandsuperoxide dismutases// An.Rev.Biochem.- 1995 - V.64.-P. 97-112). Активные формы кислорода, будучи чрезвычайно реакционно-способными, вступают во взаимодействие с клеточными компонентами (углеводы, аминокислоты, фосфолипиды, органические кислоты, основание (ДНК, РНК) и запускают окислительный стресс с образованием высокотоксичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) липидных радиотоксинов (ЛРТ) и одноэлектронного восстановления ханионов-хиноидных радиотоксинов (ХРТ) (Delencee Н. Recent advances in the radiation chemistry of proteins// Recent advances in food: radiation, Amsterdam: Flsevier Biomedical, 1983. P. 129-147). Радиоиндуцированый окислительный стресс, вызванный облучением сопровождается радиотоксинемией, радиоантигенмией, катастрофическим снижения количества и апоптопической гибелью лимфоцитов и стволовых клеток костного мозга (СКК), хромосомной перестройкой и разрывом хромосом, проявляющие, в конечном итоге, к гибели облученного организма от радиационного и эндогенного токсикоза и сепсиса.

Одной из клинических форм лучевых повреждений является лучевой токсический эффект (ЛТЭ), развивающийся после кратковременного (от минут до 3 сут) воздействия ионизирующего излучения в диапозоне доз до 10 Гр, при которой критической системой является система иммуногемопоэза с развитием костно-мозговой формы острой лучевой болезни (ОЛБ) на фоне клеточного опустошения лимфоидной и костномозговой ткани, проявляющиеся в виде панцитопении, прежде всего, лимфопении и гипофункции системы иммунитета (развития антигенемии, таксономии, сенсибилизации и эндогенной инфекции), заканчивающейся гибелью организма от радиационного атака (Клемпарская Н.Н. К методологии исследования иммунного статуса облученного организма// Сб. научн. конф.М., 1993. - С. 18-19) Кудряшов Е.Н. Лучевое поражение/Под ред. проф. Ю.Б. Кудряшова. - (Delouse Н. Recentadvancesinmeradiationchmiistryolproteins //Recentadvancesinfood: radiation, Amsterdam: Flsevier Biomedical, 1983. P. 129-147).

Из вышеизложенного следует, что образующиеся в первые часы после облучения токсические продукты перекисного окисления липидов (липидные радиотоксины - ЛРТ) и одноэлектронного восстановления хинонов (хиноидные радиотоксины (ХРТ), мишенью атаки которых являются лимфоциты и миелоциты (детерминанты выживаемости при ОЛБ), могут быть и должны быть нейтрализованы, десенбилизированы или детоксицированы впервые часы и сутки после радиационного воздействия. Именно на этом принципе основывается иммунотерапия радиационных поражений с использованием иммунотропных препаратов (нормальных, гипериммунных, реконвалесцентных сывороток и иммуноглобулинов, полученных из этих сывороток (Иммунотерапия экспериментальной острой лучевой болезни. /Под ред. Н.Н. Клемпарской. Энергоиздат, 1981.-103 с).

Результаты многочисленных исследований, суммированных в монографии А.З. Равилова и Р.Н. Низамова «Ветеринарная радиоэкология и радиоиммунология». - Казань, 2000: ФЭН, 2000. - 593 с, показали что свиные, овечьи и лошадиные сыворотки, полученные от облученных в сублетальных дозах иммунизированных лучевыми антигенами, а также гемостимулированных животных, являются достаточно высокоэффективными (стопроцентная защита при облучении в летальных дозах ЛД 80/30 и 66,6% - ная защита при облучении абсолютнолетальных (ЛД 100/30) дозах животных (белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, овец и свиней). Механизм реализации радиозащитного действия сывороточных препаратов (гипериммунных сывороток, глобулинов) обусловлен полифункциональностью иммунотропных средств (антигенно-трализирющей, токсиннотролизирирующей, антимикробной, антивирусной, антикомплементарной, антиаллергической, десенсибилизирующей и антианафилактогенной активностью), что подтверждает уникальность этих средств в инфекционной патологии.

При этом важнейшим радиозащитным свойством иммуноглобулинов и сывороточных препаратов является их способность нейтрализовать токсины микробного (энтеро - и эндотоксины экзогеннах и эндогенных микроорганизмов, принимающих активным участием в формировании общетоксического эффекта), физического (ожоговые и лучевые антигены: термо - и радиотоксины) происхождения способность сывороток крови и глобулинов дисмутировать радиоиндуцированые свободные радикалы и нейтрализовать радиотоксины, мищенью атаки которых при облучении организма являются моноциты и миелоциты (стволовые клетки костного мозга - СКК), является целесообразным, оправданным и логичным для создания на их основе высокоактивных средств лечения и профилактики радиационных поражений.

Из уровня техники известно использование противорадиационной сыворотки в качестве лечебно-профилактического средства при острой лучевой болезни, предполагающее однократное подкожное введение противолучевой сыворотки в дозах 100-125 мг/кг живой массы молодым и 200-250 мг/кг - взрослым в течение первых 1-10 сут до и через 1-10 сут после облучения (Патент RU №2169572, МГЖ А61К 35/28, А61/К 35/78, Опубл.: 27.06.2001 Бюл. №18). Противолучевую сыворотку получают путем двукратного облучения крупных млекопитающих (свиней, овец, лошадей и т.д.) на гамма - установке в дозах 50-100 Р (0,5-1,0 Гр, 1-я стадия облучения) и 300-450 (3,0-4,5 Гр, 2-я стадия облучения) и через 3 дня проводят экструзию крови дважды облученного донора с последующим отделением сыворотки, определением содержания белка (глобулина), доводят его концентрацию до 25-30 мг/мл, стимулируют и хранят в холодильнике при 4-6°С и используют по назначению.

Недостатком способа является использование весьма высоких доз (в дозе 100 - 125 мг/кг массы тела молодым животным и 200 - 250 мг/кг -взрослым), что является нерациональным перерасходом дорогостоящего лечебного средства.

Между тем, из области коллоидной и физической химии, нанотехнологии известно, что переход материи в коллоидное и наноразмерное состояние сопровождается изменением фундаментальных свойств вещества, обеспечивая высокую дисперсность, биодоступность, специфичность, повышение фармакологической активности лечебной диагностических препаратов, обладая, вследствие этого научно-техническим и социально-экономическим потенциалом (Радилов А.С., Тамбовский В.Р. Нанотехнология и ненанотоксикология - взгляд на проблему// Токсикологический вестник. -2007. - №6. - С. 4-8).

Поэтому одним из перспективных направлений использования природных веществ растительного, животного и микробного происхождения является создание на их основе наноразмерных лекарственных и диагностических препаратов с более выраженными положительными свойствами и, в связи с этим, возникает постоянная необходимость биологического тестирования наноразмерных частиц, полученных из указанных сырьевых ресурсов.

Нанотехнологии имеют огромное практическое значение для важнейших отраслей экономики и других сфер человеческой деятельности, а также в современной науке и практике, успешно применяется в различных областях (медицине, биотехнологии, химии и химической промышленности, машиностроении, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, косметике и др.). Особого внимания заслуживает нанокапсулирование, которое является весьма перспективным направлением в медицине, в частности в фармакологии. Немаловажной проблемой в области разработки и применения лекарственных веществ (ЛВ) является обеспечение избирательного, локального ЛВ, направленного непосредственно на патологический очаг в целях снижения негативного влияния на организм вцелом (Поздеев А.В., Щербаков Н.П., Вагин К.Н., Низамов Р.Н. /Методика получения липосомальных систем доставки лекарственных веществ в организм животных. Ветврач. - №3. - 2021. - С. 33-39).

Одним из многообещающих направлений исследований в медицине (в том числе и ветеринарии) является разработка идеальных способов направленного транспорта лекарств в искусственных контейнерах, которые позволят повысить эффективность и безопасность препаратов. Сама идея неинвазивной доставки ЛВ является востребованной и прогрессирующей технологией, применяемой для лечения различных заболеваний. В основе такой доставки находится пространственная изоляция ЛВ от внешней среды, благодаря внедрению их в искусственно получаемые наноразмерные оболочки (Arpicco S. Recent Studies on the delivery of hydropniligc nanoparticade systems // Drug Delivery Seiencie and Techhhnolodgy. - 2016. - V. 32. - P. 298).

На современном этапе липосомы наиболее эффективно используются в медицине в качестве носителей биологически активных веществ. Липосомы состоят из амфифильных фосфолипидов (ФЛ), которые образуют от одного до нескольких биомолекулярных слоев, и представляют собой сферические оболочки размером от 20 нм до 50 мкм, содержащие внутри воду или раствор (Nikitin A.H.et.al.//Int. I. of Pharmocyan Technology. - 2016. - V. 8. - №2. - P. 14308).

Липосомы представляют собой биоразлагаемые и биосовместимые двуслойные липидные везикулы, которые широко используются в качестве предпочтительных носителей для разумной доставки как гидрофобных, так и гидрофильных биоактивных веществ. Структурное изготовление липосом для закрепления легенда, длительной циркуляции и чувствительности к раздражителям - это передовые технологии для удовлетворения клинических и промышленных потребителей.

Благодаря открытию антител (AT), нацеливающей молекулы с высокой специфичностью к лиганду, концентрация «волшебная пуля» была успешно реализована с различными иммуноконъюгированными лекарственными средствами (ЛС). С 1980 г. для повышения специфичности и эффективности лекарственной терапии стали широко исследоваться коньюгаты AT с липосомами, т.е. иммунолипосомы (ИЛ).

ИЛ представляют собой липосомы, к которым обычно посредством специального линкера прикреплены AT, их фрагменты или иные лиганды. ИЛ используются для доставки противоопухолевых, сердечно-сосудистых, противовирусных, противопротозойных ЛС, генетического материала, визуализирующих молекул и др. ИЛ могут быть получены из различных фосфолипидов как природного, так и синтетического происхождения, зараженных или нейтральных. Наиболее широко используемыми фосфолипидными в иммунолипосомальной конструкции являются фосфатидилхолины. Для повышения механической устойчивости бислоя в липидную композицию вводят стерины. Для селективной доставки липосом нацеливающие лиганды должны быть прикреплены к наноносителю. Эти липидные конъюгаты демонстрируют превосходные амфифильные свойства и предполагают превосходные преимущества для модификации, формирования и доставки различных ЛС. Используемое AT должно усиливать накопление липосомального ЛС в целевых областях с минимальной перекрестной реактивностью со здоровыми тканями. При приготовлении ИЛ используют готовые лекарственные препараты на основе моноклональных AT, например, транстуаумаб, цетуксимаб, панитумумаб, бевацизумаб, также применяют коммерческие AT, предназначенные для исследовательской целей, и синтезированные в лабораторных условиях AT и их фрагменты. AT могут быть прикреплены к липосомам двумя основными способами: прямой ковалентной конъюгации и постинсерционным методом (Дмитриева М.В., Ярош И.В., Санарова Е.В., Ланцова А.В., Орлова О.Л. Конструкция иммунолипосом. Разработка и регистрация лекарственных средств. Том 11, №3 (2022). https://doi.org/10.33380/2305-2066-2022-11-3-97-112). Анализ данных позволил обобщить многообразие литературных данных о составе ИЛ, возможности использования вспомогательных компонентов для достижения поставленной цели при разработке препарата лечения болезней инфекционной и неинфекционной природы.

Так, результаты исследования терапевтической эффективности липосомального и суспензионного иммуноглобулинов (ИГ), приготовленных на основе 10% козьего ИГ против лихорадки Эбола, показали, что наибольший лечебно-профилактический эффект при экспериментальной лихорадке Эбола на морских свинках был достигнут при двукратном введении суспензионного ИГ против лихорадки Эбола. Отмечено увеличение инкубационного периода в 2 раза, 37,5% инфицированных животных выжило. Полученные результаты делают перспективной дальнейшую разработку новых иммуноглобулиных препаратов различных классов на основе липосом и наноэмульсий (из статьи Золина В.В., Ставского Е.А. Липосомальные и суспензионные формы иммуноглобулинов против лихорадки, Эбола как новые лекарственное препараты // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - В. 110. - с. 57-60).

Наиболее доступным исходным материалом для создания липосом являются ФЛ, изолированные из материалов природного происхождения. Так, исходным сырьем для получения ФЛ в медицинских целях чаще всего служат желтки куриных яиц или соевые бобы, однако возможно использование и других видов растительного сырья и тканей животных. Например, для получения липосом использовались яичный, соевый и арахисовый лецитин и др. Интересен также тот факт, что комплементарность липосом к определенным органам и тканям повышается при получении их из ФЛ и гликолипидов, содержащихся и выделенных из тканей этих органов.

Липосомальные формы различных лекарственных препаратов получили широкое применение в диагностике онкологических патологий, иммунологии, офтальмологии, дерматологии, неврологии и в других областях медицины. Липосомальные капсулы обеспечивают поддержание высокой концентрации ЛВ в крови и клетках организма на протяжении длительного времени, а также способствуют преодолению клеточных барьеров и доставке веществ к клеткам биомишеням, к которым иногда невозможно доставить лекарственные средства в инкапсулированных формах. Именно с этими свойствами и связано быстрое расширение области практического применения липосомальных форм веществ (Поздеев А.В., Щербаков Н.П., Вагин К.Н., Низамов Р.Н. /Методика получения липосомальных систем доставки лекарственных веществ в организм животных. Ветврач.-№3. - 2021. С. 33-39).

В качестве близкого аналога к заявляемому техническому решению в части использования липосомальных препаратов был выбран известный способ экстренной профилактики и лечения острой лучевой болезни (варианты), описанный в Патенте RU №2699040, МПК А61К 38/18, А61Р 39/00, Опубл.: 03.09.2019 Бюл. №25.

Первый вариант способа включает введение липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-протеин человека (рчАФП) в количестве 0,1-1,0 мг/мл внутривенно однократно сразу после облучения в дозе до 10 мг/кг массы в пересчете на рчАФП или в той же дозе по схеме: сразу после облучения и через 1, 3, 5, 7 суток после облучения. Второй вариант способа включает введение липосомального содержащего рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ) в количестве 0,004-0,06 мг/мл внутривенно однократно сразу после облучения в дозе до 0,2 мг/кг массы в пересчете на рчГКСФ или в той же дозе по схеме: сразу после облучения и через 1, 3, 5, 7 суток после облучения. В третьем варианте для экстренной профилактики и лечения острой лучевой болезни вводят липосомальный препарат, содержащий рчАФП в количестве 0,1-1,0 мл/мг и рчГКСФ в количестве 0,004-0,06 мг/мл. Этот препарат вводят внутривенно однократно сразу после облучения в дозе до 10 мг/мл массы в пересчете на рчАФП и до 0,2 мг/кг массы в пересчете на рчГКСФ или в тех же дозах по схеме: сразу после облучения и через 1,3,5,7 суток после облучения. Использование изобретений позволяет осуществить профилактику и лечение ОЛБ за счет регуляции роста, развития и запрограммированной гибели стволовых кроветворных клеток, дифференцировки и активации иммунных клеток стимуляции пролиферации и созревания гранулоцитосодержащих лейкоцитов крови, а также репарации радиационно-поврежденных мембран клеток.

Недостатком способа является не технологичность применения препарата, поскольку согласно предлагаемой схеме, препараты применяют внутривенно одно- и четырехкратно (через 1, 3, 5, 7 суток после облучения), что трудновыполнимо для лечения животных, что связано с проблемой фиксации животных, внутривенное введение лекарственных препаратов для животных технически трудновыполнимо.

Поэтому в практических целях были приемлемо подкожное и однократное введение лекарственных средств. Во - вторых, интегральной оценкой влияния лечебного средства на течение острой лучевой болезни является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения. Однако в данной работе животных облучали в сублетальных дозах (4,5Гр) и судить о выживаемости не представляется возможным, а оценочный критерий эффективности «эндотест» дает лишь косвенную, только предположительную информацию лечебной эффективности тестируемых лечебно-профилактических средств.

Вышеизложенное диктует необходимость разработки более эффективных средств лечения и профилактики острой лучевой болезни.

Несмотря на большой опыт по изучению способов лечения лучевых поражений, проблема создания средств экстренной профилактики и лечения ОЛБ является актуальной.

Предлагаемый способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных заявителю из уровня техники неизвестно, поэтому заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может быть использован для лечения острого лучевого токсического синдрома и соответствует критерию «промышленная применяемость».

Задачей заявляемого технического решения является разработка нового эффективного средства для лечения радиационных поражений организма.

Поставленная задача решается тем, что разработан способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных, включающий использование липосомального препарата, отличающийся тем, что в качестве липосомального препарата, используют противорадиационную иммунолипосому (ПРИЛ), содержащую 16,6 мг/мл специфические противорадиационные иммуноглобулины, конъюгированные с липосомой в соотношении компонентов 1:1.

В качестве лечебной компоненты в противорадиационном липосомальном иммуноглобулине (ПРЛИГ) используют специфические антирадиотоксические антитела (АНРА) - иммуноглобулины, которые получают путем высаливания сульфатом аммония 50% - ного насыщения глобулиновой фракции (IgG) известной противолучевой сыворотки крови двукратно облученных в дозах 0,5-1,0 Гр (первое облучение) и 3,5-4,5 Гр (повторное облучение) млекопитающих.

В качестве линкера транспортирующей части в иммунолипосоме используют липосому, полученную на основе фосфолипидов замороженной ткани головного мозга сельскохозяйственных животных (коров, свиней, баранов), экстрагируемых этанолом в течение 25-100 мин, осаждением фосфолипидной фракции 2-10-кратным объемом ацетона, выпариванием растворителя из фосфолипидной фракции на роторном испарителе, смывают хлороформом из расчета на 50 мл фосфолипидов 3,5 хлороформа, перемешивают содержимое колбы до полного растворения осадка и хлороформ удаляют в роторном испарителе.

Противорадиационную иммунолипосому (ПРИЛ) получают путем растворения липосомы (30 мг) в 3 мл смесь эфир-хлороформ (2:1) (10%-ный раствор липосомы), которую вносят в круглодонную колбу емкостью 100 см³ роторного испарителя. Включаемый (инкапсулируемый) материал (лечебная компонента иммунолипосомального конъюгата), представляющая собой 10% - ный раствор противорадиационного иммуноглобулина (ПРИГ) в количестве 1 мл (100 мг IgG) добавляют в соотношении 1:1 (раствор липосомы: раствор иммуноглобулина) и обрабатывают ультразвуком на аппарате УЗДН-2Т (или аналогичном) частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт в течение 30 сек дважды. Образовавшая эмульсия выпаривают на роторном испарителе до исчезновения запаха растворителя. К образовавшемуся 1 мл гелю, содержащему 30 мг/мл липосомы и 100 мг/мл иммуноглобулина, добавляют 5 мл/0,01М фосфатного буфера (рН 7,5) (соотношение гель: фосфатный буфер 1:5). Содержание активно - действующего вещества (АДВ) в полученной иммунолипосомальной суспензии составляет 16,6 мг/мл. Полученный вышеописанным способом иммунолипосомальный конъюгат подвергают радиостерилизация путем γ-облучения в дозе 2,5 кГр, разливают в ампулы или флаконы и хранят в нативном или лиофилизированном виде в холодильнике при температуре 4-6°С и применяют по назначению.

Полученные по вышеописанный технологии иммунолипосомы обеспечивают эффективное экстренное лечения ОЛБ и состоит из 3 этапов: получение противорадиационных глобулинов, получении липосом и конструирование иммунолипосомы путем инкапсулирования иммуноглобулинов в липосомы.

На первом этапе получают противорадиационные иммуноглобулины из сывороток крови двукратно облученных крупных млекопитающих (свиней, овец, лошадей и т.д.) на гамма-установке в сублетальных (0,5-1,0 Гр) и (через 30 дней - в летальных (3,5-4,5 Гр) дозах и по истечении 7 дней после повторного облучения у животных берут кровь из яремной вены в стеклянные емкости, оставляют на суток при 12-15°С, затем сыворотку крови центрифугируют при 2500 об/мин в течение 20 мин, супернатант декантируют и из него выделяют глобулины путем обработки сульфатом аммония 50%-ного насыщения. Глобулиновую фракцию изолируют путем центрифугирования смеси при 2500 об/мин в течение 20 мин, супернатант подвергают диализу против фосфатного - солевого буфера, затем определяют в ней содержание гамма - глобулинов по общепринятой в иммунологии методике (см. кн. Экспериментальная иммунология. Под ред. Н.В. Холчева - М.: Медицина, 1968. - 665 с). Содержание иммуноглобулинов в полученной фракции определяют гравиметрическим методом (высушивание суспензии до постоянной массы с последующим взвешиванием осадка на аналогичных весах). Осадок разводят физиологическим раствором рН 7,4 до 10%-ной концентрации (100 мг/мл). Биологическую (противорадиационную лечебную) активность IgG определяют на белых мышах, используя по 5 животных на каждый вариант (лечебное и профилактическое применения IgG) опыта. Иммуноглобулин вводят однократно подкожно в дозе 0,1 мг за 1-10 суток до и через 1-10 сут после абсолютно летального (9,0 Гр) облучения животных. Результаты опытов показали, что выживаемость животных при лечебном и профилактическом применении обеспечивают 60% -ную выживаемость летально (ЛД 100/30) облученных животных.

На втором этапе технологического цикла получают липосомы. В качестве источника фосфолипидов для получения липосом используют головной мозг крупного (КРС), мелкого (МРС) рогатого скота и свиней, замороженный головной мозг с. - х. животных по ГОСТ 16677-2017, который подвергают этаноловой экстракции при соотношении биомасса: экстракт 1:1-1:50. Экстрагент отгоняют на роторном испарителе. Состав фосфолипидов в полученном осадка определяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинке «Синрол» (см. кн. Кейтте М. Техника липидологии М.: Мир, 1975. - С. 68-82). Липиды, получения вышеописанным способом, состоящие из фосфотидилхолина (ФСХ), фосфатидилсерина (ФХС), фосфатидилинозита (ФСИ) и холестерина (ХЛТ).

Далее проводили выпаривание экстракта липидов на роторном испарителе для образования геля на стенках колбы. Данный этап очень важен в связи с тем, что пленка липидов должна быть достаточно тонкая, иначе происходит нежелательное включения значительного количества фосфолипида в систему концентрических бислоев, так как замкнутые мембраны будут эффективно предотвращать дальнейший доступ воды.

Далее смывали высушенные липиды хлороформом (из расчета на 50 мг липида 3,5 хлороформа), перемешивали колбу до полного растворения осадка и хлороформ удаляли в роторном испарителе. Определение размеров липосом проводили на электронном микроскопе и рассчитывали по формуле. Размер полученных липосом составил 100-200 нм.

На третьем этапе технологического цикла получают липосомально-иммуноглобулиновой комплекс (противорадиационная иммунолипосома (ПРИЛ).

Для этого липосомы в количестве 30 мг растворяют в 3 мл смеси эфиром в соотношении 2:1 и вносят в круглодонную колбу емкостью 100 см³ роторного испарителя. Включаемый (инкапсулируемый) материал - противорадиационный иммуноглобулин в количестве 1 мл (100 мг/мл) добавляют к раствору липосомы (соотношение 1:4) и отрабатывают ультразвуком на аппарате УЗДН-2Т (или другом аппарате с аналогичными параметрами) частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт в течение 30 сек дважды. При этом образуется эмульсия типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижают давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляют. Об окончании выпаривании судят по образованию геля в колбе и исчезновения запаха растворителя. Колбу снимают с испарителя, к образовавшимуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4) и встряхивают до образования гомогенной структуры суспензии. В полученный суспензии активно - действующих веществ (АДВ) определяют гравиметрическими методам и методом хромотографического анализа. Гравиметрический метод предусматривает определение массы сухового вещества после высушивания суспензии (мг/мл), а процентное соотношение компонентов - на хроматограммах путем сравнивания пиков хроматограмм с использованием стандартов иммуноглобулинов и липосом.

Установлено, что в иммунолипосомальном комплексе содержание глобулинов составляет 16,6 мг/мл.

Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и концентрирование иммуноглобулина в противолучевой сыворотке. Учитывая, что в получаемых по известному способу противолучевых сыворотках содержание глобулинов колеблется в пределах не более 5%, и с целью повышения концентрации глобулинов в лечебном препарате, уменьшения объема вводимого лечебного средства, который составляет от 200 до 400 мл в зависимости живой массы животных (эффективные лечебные дозы - от 100-175 до 200-250 мг/мл живой массы), из полученных по известному способу лечебных сывороток выделяли глобулиновую фракцию путем высаливания насыщенным раствором (50% -ная насыщенности) сульфата аммония.

Обработанная сульфатом аммония противолучевые сыворотки центрифугировали при 2500 об/мин в течение 20 мин, супернатант подвергали диализу против дистиллированный воды, затем определяли содержание гамма-глобулинов по общепринятой в иммунологии методике (см. кн. Экспериментальная иммунология. Под ред. Н.А. Холечева. - М.: Медицина, 1968. - 665 с). Идентификацию гамма - глобулинов (IgG) в диализате проводили в ИФА-тесте с использованием энзим - меченых моноклональных антиглобулиных антител (МКА) по методике, изложенной в «Методах исследовании в иммунологии» Под ред. И. Лефковитса. - М.: Мир, 1981. - 289 с».

Результаты идентификации гамма - глобулинов в ИФА-тесте с использованием энзим - меченых моноклональных антител (МКА) показали, что выделенная из известной противорадиационной сыворотки иммуноглобулиновая фракция содержит 90% иммуноглобулины класса G (IgG), а концентрация иммуноглобулинов в препарате составляет 10% (100 мг/мл), что превышает таковую в известной сыворотке в 4,5-5 раза.

Изменение степени насыщения сульфата аммония при высаливании иммуноглобулинов (30, 35, 40, 45, 55, 60, 65%) ведет к снижению содержания IgG в глобулиновой фракции и приводит к повышению IgM и IgA - фракций сыворотки.

Пример 2. Определение оптимального соотношения компонентов (лечебного и транспортирующего) в иммунолипосоме.

Для определения оптимального соотношения компонентов в лечебном препарате (иммунолипосомы) готовили различных композиции иммуноглобулин - липосома с различным соотношении компонентов: 1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:6,1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 10:1,9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 3:2, 3:3, 3:4, 4:4, 4:3, 4:2, 4:1, 4:0,5, 4:0,3, 4:0,2, 4:0,1.

В качестве критерия оценки оптимального соотношения компонентов в липосоме использовали степень коньюгирования иммуноглобулина с липосомой, которую определяли по результатам электронного микроскопирования. Результаты опытов показали, что 87%-ное связывание компонентов в иммунолипосоме достигается при соотношении компонентов 4:1.

Таким образом, в результате проведенных исследований с использованием методов электронного микроскопирования и расчетным методом показали, что оптимальное соотношение компонентов (нацеливающей части-липосомы и лечебной части - противорадиационного иммуноглобулина) составляет 4:1, которое обеспечивает получение радиотерапевтического комплекса-иммунолипосомы с содержанием АДВ 16,6 мг/мл.

Пример 3. Определение эффективности лечебной дозы противорадиационного иммунолипосомального препарата

Для определении оптимальной лечебной дозы препарата опыты проводили на беспородных белых мышах обоего пола живой массой 20-25 г., которые были разделены на 8 групп по 7 животных в каждый. Моделирование ОЛБ осуществляли путем летального облучения (7,7 Гр) животных на гамма -установке «Пума» с мощностью экспозиционной дозы 400 Р./ч., мощность дозы установки.

Через 24 ч после облучения животным 1-7 групп однократно подкожно вводили иммунолипосомальный глобулин в дозах 0,2 мг/мл, 0,4, 0,8, 1,0, 3, 5, 10 мг/кг соответственно. Облученным животным 8-группы препарат не вводили и они служили контролем облучения.

За животными вели клинические наблюдения в течение 30 сут, регистрируя павших и выживших животных. Критерием эффективности испытуемых доз препарата служила 30 - суточная выживаемость летально облученных животных, которую выражали в процентах защиты (ПЗ %).

Результаты динамического 30 - суточного наблюдения летально облученных и леченных животных показали, что 71,4%-ная выживаемость наблюдались при однократном подкожном введении иммунолипосомы в дозах 0,4-10,0 мг/кг. Снижение дозы до 0,2 мг/кг и проводило к снижению лечебного эффекта (42,8%-ная выживаемость), а повышение дозы тестируемого препарата (0,8; 1,0; 3,0; 5,0 и 10,0 мг/кг) не вызывало увеличение количества выживших животных, а увеличивало расход лечебного средства.

Результаты опытов по определению оптимальной лечебной дозы предлагаемого лечебного средства оказалась, что оптимальной (эффективной) лечебной дозой препарата является 0,35-0,45 мг/кг, обеспечивающая защиту от радиационной гибели более 70% животных. Изменение лечебной дозы в сторону уменьшения приводит к снижению лечебного эффекта, а повышение не приводит к увеличению выживаемости, а к перерасходу лечебного средства.

Пример 4. Оценка лечебной эффективности липосомального иммуноглобулина.

Для оценки лечебной эффективности предлагаемого средства проводили опыты на летально облученных в дозе 7,7Гр (ЛД100/30) беспородных белых мышах обоего пола живой массой 18-25 г, которые были разделены на 5 групп по 20 животных в каждой. Животным 1-й группы через 24 ч после облучения однократно подкожно вводили известную противорадиационную сыворотку в дозе 200 мг/кг по белку согласно Патенту RU №2169572 (контроль препарат по аналогу 1), 2-й группы - однократно подкожно 0,4 мг/кг (предлагаемый препарат), 3-й группы - однократно внутривенно сразу после облучения в дозе до 10 мг/кг массы в перерасчете на рчАФП - до 0,2 мг/кг в перерасчете на рчГКС (контроль препарата по отношению к аналогу 2 (Патент RU №269904), 4-й группы - однократно подкожно вводили 10 мг/кг пустую липосому (контроль липосомы КЗ); летально облученным животным 5-й группы препараты не вводили и они служили контролем облучения (Ко).

За животными вели динамическое наблюдение в течение 30 сут после облучения и лечения, регистрируя павших и выживших в ходе экспериментов. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Из представленных в таблице 1 данных видно, что однократное подкожное введение через 24 ч после облучения летально облученным мышам известного лечебного средства - противорадиационной сыворотки, полученной от дважды облученных животных, приводило к увеличению выживаемости 60% животных (группа 1) по сравнению с контролем облучение (группа 5). Максимальный лечебный эффект (75%-ная защита от радиационной гибели) наблюдалось при однократном подкожном введение предлагаемого средства - иммунолипосомального препарата в дозе 0,4 мг/кг (группа 2). Следовательно, применение иммунолипосомального препарата способствовало увеличению выживаемости летально облученных животных в

1,42 раза по сравнению с известной противолучевой сывороткой при одновременном существенном (5-кратном) снижении эффективной лечебной дозы, составляя 0,4 мг/кг против 200 мг/кг у известного препарата. Использование известного препарата - иммунолипосомы, содержащей 10 мг фосфолипидов, 0,2 мг рчАФП и 0,02 мл рчГКС (К₂ - аналог 2 по патенту №2 699 040 С1) обеспечивало 45%-ную выживаемость летально облученных животных, что значительно (на 30%) ниже по сравнению с предлагаемым противорадиационным липосомальным иммуноглобулином.

Введение «пустой» (не содержащей противорадиационный иммуноглобулин) липосомы также оказывало радиозашитной эффект, обеспечивая выживание 25% летального облучения животных (группа 4).

Заключение. Таким образом, использование иммунолипосомального препарата на основе противорадиоционного иммуноглобулина в дозе 0,4 мг/кг живой массы при однократном подкожном введении через 24 ч после облучения обеспечивает 85%-ную выживаемость летально облученных животных, что в 1,42 раза превышает таковую аналога 1 при одновременном существенном (5 - кратном) снижении эффективности лечебной дозы известного препарата.

Использование известного липосомального препарата по аналогу 2 также приводит к увеличению выживаемости летально облученных животных, обеспечивая 45% - ную выживаемость, что уступает предлагаемому в 1,09 раза, что по - видимому объясняется только однонаправленным (колониестимулирующим) действием известного препарата. Представляет значительный интерес использование пустой (не содержащей лечебный компонент) липосомы, которая обеспечивает 25%-ную защиту летально облученных животных, что открывает перспективу использования их в качестве радиозащитных препаратов.

Пример 5. Оценка лечебно-профилактического действие противорадиоционного иммунолипосомального препарата.

Опыты проводили на 112 беспородных белых мышах живой массой 20-25 г, разделенных на 16 групп по 7 животных в каждой. Животным первый группы (1-я групп) за 12 ч, 24, 3, 5, 7, 10, 12, 24 и 3, 5, 7,10, 12, 14 сут до летального облучения однократно подкожно вводили испытуемый препарат в дозе 0,4 мг/кг живой массы, животным второй группы (9-14 группы) - через 12, 24, 3, 5, 7,10,12,14 сут после летального облучения в анологичных дозах с лечебной целью соответственно. Моделирование острой лучевой болезни тяжелой степени тяжести осуществляли путем однократного внешнего гамма -облучения на установке «Пума» в дозе 7,7 Гр (ЛД 100/30). За животными вели динамические (ежедневные) наблюдения, регистрируя павших и выживших животных в соответствующих группах мышей. Оценку радиозащитного действия испытуемого препарата проводили по критерию выживаемости в процентах (ПЗ, %). Результаты изучения радиозащитной эффективности препарата в зависимости от срока введения представлены в табл. 2.

Из таблицы 2 видно, что однократное подкожное введение испытуемого препарата в дозе 0,4 мг/кг как до (до 1, 3, 5, 7, 10 сут), так и после (через 1, 3, 5, 7, 10 сут) летального облучения оказывает радиозащитное действие, обеспечивая 85,7% -ную защиту животных от радиоционной гибели.

Введение препарата за 12 ч до и через 12 ч после облучения не создает радиорезистентности и не оказывает, выраженного противолучевого эффекта, который составляет не более 42,8- 28,3% защиты.

Таким образом, испытуемый препарат обладает бифункциональным (лечебно-профилактическим) действием, создавая радиорезистентность организма к внешнему γ - облучению при однократном подкожном введении противорадиационного липосомального иммуноглобулина в дозе 0,4 мг/кг за 24 ч, 3, 5, 7, 10 сут после облучения, обеспечивал более 80-% -ную выживаемость летально облученных животных.

Пример 6. Обоснования использования мозговой ткани сельскохозяйственных животных в качестве источника фосфолипидов (технического сырья) для получения липосом.

Учитывая, что наиболее широко используемыми источниками фосфолипидов для конструирования липосом является сырье растительного (соя, кукуруза, подсолнечник) и животного (куриное яйцо, ткани головного мозга крупного, мелкого рогатого скота и свиней) происхождения, в качестве источников фосфолипидов при конструировании противорадиационных иммунолипосом использовали фосфолипиды, полученные из растительного (соя), животного (яйца куриные, ткань головного мозга КРС, МРС и свиней, а также отход мясоперерабатывающей промышленности - смесь замороженной ткани головного мозга КРС, МРС и свиней по ГОСТ 16677-2017.

С целью обоснования целесообразности использования различных источников фосфолипидов и определения их пригодности для конструирования иммунолипосом получали различные образцы иммунолипосом с последующим тестированием их радиозащитной (лечебной) эффективности. При этом получены следующие образцы иммунолипосом: 1) иммунолипосома на основе ФЛ, полученных из сои (ИЛС), 2) иммунолипосома на основе ФЛ, полученных из куриных яиц (ИЛЯ), 3) иммунолипосомы, полученные из ФЛ головного мозга крупного рогатого скота - КРС (ИЛК), 4) иммунолипосома, полученная на основе ФЛ из головного мозга МРС (овец) (ИЛО), 5) иммунолипосома, полученная на основе ФЛ, полученных из мозга свиней (ИЛС) и 5) иммунолипосома, полученная из мозга КРС, МРС и свиней (ИЛ KMC).

Для получения ФЛ использовали материалы и методы, согласно патентам RU №2192265 и №2279885.

Радиозащитную активность полученных иммунолипосом на основе ФЛ из испытуемых источников технологического сырья проводили на 84 летально облученных дозе 7,7 Гр беспородных белых мышах обоего пола живой массой 20-25 г, разделенных на 6 групп по 14 животных в каждой. Острую лучевую болезнь тяжелой степени животных моделировали путем однократного внешнего у- облучения мышей на установке «Пума» с источником ионизирующих излучений ⁶⁰Со при мощности экспозиционной дозы Гр/мин. За облученными и летагенными животными вели динамическое (ежедневное) наблюдение, регистрируя павших и выживших животных в течение 30 сут и оценивая радиозащитную эффективность в процентах 30-суточной выживаемости (ПЗ %).

Результаты проведенных исследований по сравнительной лечебной эффективности исследуемых образцов или иммунолипосом на основе ФЛ различного происхождения представлены в табл.3.

Из таблицы 3 видно, что максимальная радиационная защиты летально облученных животных на фоне лечебного применения ИЛ, полученных на основе липосом из ФЛ растительного и животного происхождения, достигается при однократном подкожном введении ИЛ №6 (ИЛ на основе смеси головного мозга КРС, МРС и свиней), и составляла 85%. Использование иммунолипосом на основе липосом, полученных на основе ФЛ сои, куриных яиц, головного мозга КРС и МРС, свиней показало также достаточно высокую радиозащитную эффективность (65,0; 71,4; 78,6; 71,4%-ная защита соответственно, препараты №1, 2, 3, 4). Использование головного мозга свиней (ИЛ №5) в качестве источника ФЛ для получения липосом с последующим конструированием на их основе иммунолипосомы обеспечивало повышение радиозащитной эффективности до 80%. Максимальная радиозащитная эффективность из испытанных вариантов иммунолипосом достигнута при использовании препарата №6 (иммунолипосома, изготовленная на основе липосомы из ФЛ, полученных на основе отходов мясоперерабатывающей промышленности - замороженного головного мозга сельскохозяйственных животных (коров, овец и свиней) по ГОСТ 16677.

В результате сравнительного изучения по выбору и обоснованного оптимального источника ФЛ основного компонента липосом, установлено, что из испытанных наиболее широко применяемых источников ФЛ при изготовлении липосом: сои, куриных яиц и головного мозга животных, установлено, что максимальная радиозащитная (лечебная) эффективность достигается при применении иммунолипосомы, изготовленной на основе ФЛ, полученных из смеси головного мозга КРС (коров), МРС (овец) и свиней, которые обеспечивали 85%-ную выживаемость летально облученных (ЛД 100/30) животных. Высокая радиозащитная эффективность противорадиационной иммунолипосомы (ПРИЛ) обусловлено как использованием противорадиационного иммуноглобулина-основного компонента создающего радиозащитной эффект в лечебном препарате, так и использованием сбалансированного эквимолярного состава комплекса ФЛ с содержанием 16,6% холестерина, цереброзидов, фосфатидилэтаноламина, 8,3% фосфоатидилхолина и сфингомиелина, 6,25% фосфатиделсерина и фосфатидилинозита (см. Патент RU №2192285). При использовании других источников ФЛ такого оптимального соотношения компонентов не удается.

Кроме того, согласно Патента RU №2279885, замороженный головной мозг сельскохозяйственных животных по ГОСТ 16677, содержит аминокислоту цистеин, которая является естественным радиопротектором (cM.Radiation Biology. A.Hollender, ed. - V1. - Mc Graw-Hill. №Y. - 1934-367 p). Следовательно, конечной радиозащитной эффект противорадиационной иммунолипосомы достигается благодаря суммации противолучевых эффектов естественного радиопротектора-цистеина, содержащегося в смеси головного мозга КРС, МРС и свиней, и главное - глобулинов противорадиационной лечебной сыворотки, полученной от двукратно облученных сублетальной и летальной дозой у - лучей животных.

Пример 7. Изучение антирадиотоксического действия (антирадиотоксикоза) иммунолипосомы.

Для изучения антитоксического действия предлагаемой иммунолипосомы, проводили опыты на 15 белых крысах, разделенных на 3 группы по 5 животных в каждой.

Моделирование ОЛБ тяжелый степени у животных 1-й и 2-й групп осуществляли путем внешнего облучения на гамма - установке «Пума» с источником излучений ⁶⁰Со в дозе 9,0 Гр (ЛД100/30). Через 24 ч после облучения животным однократно подкожно вводили используемую противорадиационную иммунолипосому (ПРИЛ) в дозе 0,4 мг/кг живой массы. Животным 3-й группы препарат не вводили и они служили биологическим контролем. У всех животных через 3, 7 и 14 сут после облучения и введения лечебного средства брали пробы крови и в ней определяли содержание лимфоцитов, а в сыворотке крови определяли концентрацию радиоиндуцированных токсических продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Содержание конечных продуктов окисления липидного радиотоксина (ЛРТ) - малондиальдегида (МДА), определяли по М.С.Гончаренко «А.М. Латиновой (Методика определения малонового диальдегида в сыворотке крови животных/АЛабораторное дело, 1985.-№1-С.60-61). Содержание липидного радиотоксина выражали в эквивалентном количестве малонового диальдегида (МДА), используя коэффициент молярной экстинции, равной 1,56x10⁵ (моль/л) см^-1.

Спектр поглощения окрашенного продукта с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) записывали на спектрофотометре «СФ-46».

Результаты биохимических гематологических исследований представлены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 видно, что летальное облучение животных индуцировало резкое повышение концентрации липидного радиотоксина (МДА), которая превышала контрольные значения в 1,85-2,23 раза и вызывало резкое (достоверное) снижение содержание лимфоцитов (в 4,38-6,43 раза по сравнению с исходным уровнем (Р<0,801).

Сопоставительной анализ этих данных показывает, что между изученными показателем существует тесная обратная корреляция - с увеличением концентрации радиотоксина (МДА) в крови регистрируется усиленная радиоиндуцированная апоптопическая гибель лимфоцитов (детерминантов выживаемости облученного организма). При таких биологических и гематологических показателях животные 1-й группы погибали от интоксикации радио - и эндотоксинами на 12-15-ые сут после облучения.

Однократное подкожное введение предлагаемого

противорадиационного средства - иммунолипосомы в дозе 0,4 мг/кг живой массы ингибировало (торможение) синтез липидных радиотоксинов (ЛРТ/МДА), концентрация которых на фоне применения препарата: на 3-й сут после введения препарата летально облученным животным концентрации их в сыворотке крови снижалась в 1,55 раза, на 7-е сут - в 1,79 раза и на 14-е сут - в 2,12 раза (Р<0,001). Резкое уменьшение концентрации липидного радиотоксина (ЛРТ) в организме на фоне применения противорадиационного иммунолипосомального препарата сопровождалось ингибированным апоптотической гибели лимфоцитов, предотвращение катастрофической гибели детерминантов выживаемости при различной патологии, предотвращая радиационную гибель макроорганизма (выживаемость -85%).

Сопоставительный анализ полученных результатов биохимических и гематологических исследований позволили рассчитать коэффициент эффективности антитоксической защиты организма на фоне применения средства противорадиационной защиты. Как видно из данных таблицы 4, применение испытуемого радиозащитного средства резко уменьшает (в 8,0 раз, Р<0,001) коэффициент К по отношению к облученному контролю, приближая значение этого показателя к контрольному уровню (К=1,02 при значении К-1,48 у леченных животных). Одновременно этот показатель дает прогностическую информацию о благоприятном или неблагоприятном исходе радиационного поражения (при значимых К=9,5-12,1 - прогноз неблагоприятный, при значениях К=4,5-8,5-сомнительный, а при значениях К=2,7-3, -благоприятный).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что испытуемый препарат - противорадиоционный липосомальный иммуноглобулин (ПРИГ) обладает выраженным антирадио-токсикологическим действием, эффективно нейтрализуя один из главных радиотоксинов-продуктов пероксидации липидов - малондиальдегида (МДА), мишенью атака которых являются лимфоциты, выступающие в качестве детерминантов выживаемости макроорганизма при радиоционной патологии. Инактивация липидных радиотоксинов (МДА) на фоне применения иммунолипосомального препарата обуславливает создание необходимого уровня лимфоцитов, моноцитов, микро- и макрофагов и фагоцитов, впредосвращая пострадиационную апоптотическую гибель лимфоцитов и моноцитов (стволовых клеток костного мозга), что обеспечивает высокую (75-80%-ную) выживаемость летально облученных животных, предотвращая, тем самым лучевой токсикоз, ведущей к пострадиационному летальному сепсису. Подытоживая вышесказанное, можно сделать следующее выводы:

1. В сравнении с аналогом I, заявляемый способ обеспечивает с высокой эффективностью (оптимальные лечебной дозы иммунолипосомального средства уменьшаются в 40-80 раза и лечебный эффект увеличивается в 1,4 раза и обеспечивает возможность профилактики и ОЛБ.

2. По сравнению с аналогом II, заявляемый способ является более технологичным, поскольку обеспечивает более простой - и легковыполняемый способ - (подкожное) введение лекарственных средств пациентам, поскольку внутривенное введение крупным животным (хряки, бараны, быки, лошади и т.д.) технически трудновыполнимо и опасно для жизни оператора.

3. Комбинированный липосомальный препарат, содержащий противорадиационной иммуноглобулин (лечебный компонент) липосому (нацеливающей, транспортирующей компонент), благодаря суммации фармакологических эффектов (радиотоксиннейтрализующий, антианафилактогенный, десенсибилизирующий, радиоантигеннейтрализующ ий эффекты иммуноглобулинов и радиопротекторный - антирадикальный эффект фосфолипидов липосомы благодаря наличию в составе заямороженного мозга сельскохозяйственных животных (коров, баранов, свиней) радиопротектора - цистеина, обеспечивает усиление радиотерапевтического эффекта, обеспечивая 80%-ную защиту летально облученных животных от радиационной гибели, экстренно (первые 1-10 сут после нанесения различного стресса, создающего острый токсической синдром с развитием радиотоксимии (и радиоантигенами), ведущие к апоптозу лимфоцитов (детерменантов выживаемости) при радиационным поражении организма путем экстренной нейтрализации их с помощью антирадиотоксических антител и естественного радиопротектора-цистеина.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарной медицине для лечения и профилактика радиационных поражений организма. Разработан способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных, включающий использование противорадиационной иммунолипосомы (ПРИЛ), содержащей 16,6 мг/мл специфических противорадиационных иммуноглобулинов, конъюгированных с липосомой в соотношении компонентов 1:1, где в качестве лечебной компоненты в противорадиационном липосомальном иммуноглобулине (ПРЛИГ) используют специфические антирадиотоксические антитела (АНРА). 4 табл., 7 пр.

Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма, включающий использование липосомального препарата, отличающийся тем, что в качестве липосомального препарата используют противорадиационную иммунолипосому, содержащую 16,6 мг/мл специфических противорадиационных иммуноглобулинов, конъюгированных с липосомой в соотношении 1:1;

где в качестве лечебной компоненты в противорадиационном липосомальном иммуноглобулине используют специфические противорадиационные антитела - иммуноглобулины, которые получают путем высаливания сульфатом аммония 50%-ного насыщения глобулиновой IgG-фракции известной противолучевой сыворотки крови двукратно облученных в дозах 0,5-1,0 Гр первое облучение и 3,5-4,5 Гр повторное облучение млекопитающих, а в качестве транспортирующей части - иммунолипосому, полученную на основе фосфолипидов замороженной ткани головного мозга сельскохозяйственных животных, экстрагируемых этанолом в течение 25-100 мин;

затем обрабатывают ультразвуком на аппарате УЗДН-2Т с частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт в течение 30 с дважды; осаждают фосфолипидную фракцию 2-10-кратным объемом ацетона, выпаривают растворитель из фосфолипидной фракции на роторном испарителе, смывают хлороформом из расчета 3,5 мл хлороформа на 50 мл фосфолипидов, перемешивают содержимое колбы до полного растворения осадка и хлороформ удаляют на роторном испарителе;

причем противорадиационную иммунолипосому получают путем растворения липосомы в смеси эфир-хлороформ при соотношении 2:1 с получением 10%-ного раствора липосомы, которую вносят в круглодонную колбу роторного испарителя до образования геля до исчезновения запаха растворителя, затем растворяют в 0,01М фосфатном буфере до рН 7,5 при соотношении 1:5 и инкапсулируют 10%-ный раствор противорадиационного иммуноглобулина, после чего подвергают радиостерилизации путем γ-облучения в дозе 2,5 кГр.