СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-ГАММА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12P21/02 C12N15/23 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу получения рекомбинантого иммунного интерферона (интерферон-гамма; ИНФ-γ) человека. Предлагаемый способ позволяет легко масштабировать процесс выделения и очистки данного биологически активного вещества.

ИНФ-γ является полуфункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы (иммунный интерферон), обладает иммуностимулирующей, противоопухолевой и антивирусной активностями. Создание микроорганизмов-продуцентов человеческого ИНФ-γ позволило получать биологически активный рекомбинантный белок в количестве, необходимом как для проведения широких структурно-функциональных исследований, так и для использования в медицинской практике. За рубежом созданы лекарственные препараты на основе рекомбинантного ИНФ-γ для лечения иммунных, онкологических и тяжелых вирусных заболеваний (иммуномакс, иммунерон и др.). В связи с этим разработка эффективных способов получения рекомбинантного ИНФ-γ является актуальной.

Известны способы [1-3] получения рекомбинантного ИНФ-γ человека, но все они трудоемки, дорогостоящи, описаны для аналитических количеств белка и трудно масштабируемы; к тому же рекомбинантный иммунный интерферон человека, синтезирующийся в клетках Escherichia coli, образует при суперпродукции нерастворимые тела включения, осаждающиеся при центрифугировании разрушенных бактериальных клеток совместно с обломками клеточных стенок. Разрушение ультразвуком в среде, не содержащей денатурирующих агентов, или ферментативный лизис E.coli сопровождается активацией мембраносвязанной протеазы, способной к ограниченному гидролизу гамма-интерферона по последовательности, содержащей подряд четыре основных аминокислоты в концевой части молекулы [1,4].

Наиболее близким к заявленному способу является способ [5; прототип], позволяющий получить интактный нативный ИНФ-γ, который включает несколько стадий: химический лизис клеток штамма-продуцента E.coli и одновременная солюбилизация ИНФ-γ из телец включения раствором 7М гуанидинхлорида; удаление нерастворившихся компонентов центрифугированием; 10-кратное разбавление целевой фракции буфером pH 9,5 и отделение образующегося осадка белков центрифугированием; фракционирование белков на силикагеле (NuGel-952 AC); и, наконец, аффинная хроматография на сорбенте с моноклональными антителами. Полученный продукт находится в растворе 20 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1M NaCl и 1М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представляет собой белок с молекулярной массой 18000, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составляет 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составляет 10⁷ ед./мг белка.

Недостатком способа-прототипа является то, что одновременное разрушение клеток и солюбилизация ИНФ-γ не дают возможности использовать одно из преимуществ образования телец включения, заключающееся в легком отделении балластных водорастворимых белков бактериальной цитоплазмы от нерастворимого целевого продукта простым центрифугированием. Использование иммунного сорбента для очистки белка очень дорого, нетехнологично, трудно масштабируемо. Требуется дополнительный сложный анализ конечного продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка технологического легкомасштабируемого способа получения высокоочищенного нефрагментированного ИНФ-γ человека.

Для сохранения возможности удаления водорастворимых белков и сохранения интактным рекомбинантого иммунного интерферона человека может быть использовано введение в буфер для механической дезинтеграции ультразвуком клеток продуцента солей цинка и меди, которые, как показано в [4], присутствуя в среде в низких концентрациях, ингибируют разрушающую гамма-интерферон мембраносвязанную протеазу E.coli.

Солюбилизирующие свойства хлорида гуанидина, одного из наиболее сильных и часто используемых для растворения тел включения денатурирующих агентов, могут быть смоделированы смесями мочевины и хлористого лития [6], которые, в отличие от гуанидина, могут быть использованы для более селективной экстракции продукта. Кроме того, ренатурация из растворов мочевины происходит более эффективно, чем из растворов гуанидина [6].

Таким образом, поставленная цель достигается тем, что разрушение клеток продуцента, содержащего рекомбинантый ИНФ-γ в виде телец включения, проводят в буферном растворе в присутствии солей цинка и меди, ингибирующих мембраносвязанную протеазу, разрушающую ИНФ-γ, солюбилизацию продукта осуществляют смесью мочевины и хлористого лития, а хроматографию проводят на катионообменнике CO-OH-Биохром К-1 с повышенной обменной емкостью, представляющем собой сополимер метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита.

Разрушение клеток в буферном растворе позволяет простым центрифугированием клеточного экстракта отделить большую массу балластных клеточных белков E. coli от нерастворимого целевого продукта, находящегося в тельцах включения, при этом соли цинка и меди позволяют предотвратить протеолитическую деструкцию целевого белка. Применение для солюбилизации ИНФ-γ из телец включения менее сильного чем гуанидинхлорид денатурирующего агента - мочевины, обеспечивает более эффективную ренатурацию белка [6]. Использование для хроматографической очистки сорбента COOH-Биохром К-1 значительно упрощает и удешевляет способ по сравнению с использованием иммунного сорбента. К тому же этот сорбент выгодно отличается от широко используемой в препаративной хроматографии белков КМ-целлолозы своей высокой обменной емкостью и способностью выдерживать высокие давления (до 70 атм). При этом применение COOH-Биохрома К-1 допускает использование оборудования для хроматографии низкого и среднего давления, и, следовательно, не дает заметного увеличения стоимости проведения стадии хроматографии.

Предлагаемый способ получения и очистки рекомбинантного иммунного интерферона человека, образующего в клетках E.coli нерастворимые тела включения, состоит из нескольких последовательных этапов:
1. Клетки продуцента разрушают ультразвуком в буфере, содержащем соли меди и цинка, ингибирующие мембраносвязанную протеазу, способную деградировать гамма-интерферон. В качестве продуцента может быть использован любой генетически трансформированный штамм E.coli, накапливающий иммунный интерферон в виде тел включения. В данном случае выделение проводится из штамма E. coli MH1 [pIFN-γ-trp2], в котором экспрессия гена гамма-интерферона контролируется промотором триптофанового оперона E.coli. Уровень биосинтеза иммунного интерферона при конститутивном синтезе составляет порядка 10% от общего белка клетки и около 50% - при индукции триптофанового промотора [7].

2. Нерастворимую форму гамма-интерферона собирают центрифугированием суспензии разрушенных ультразвуком клеток и промывают 4М раствором мочевины для удаления примесных белков.

3. Иммунный интерферон солюбилизируют в 8М мочевине, содержащей хлористый литий в концентрации большей либо равной 5М в слабощелочной среде (предпочтительнее при pH 9,5).

4. Растворенный ремомбинантый белок обессоливают гель-фильтрацией в 8М мочевине, pH 9,5, или диализом против 8М мочевины, pH 9,5.

5. Раствор обессоленного белка наносят на колонку с катионообменником COOH-Биохромом К-1 с высокой ионообменной емкостью и высокой сорбционной способностью по белку, уравновешенную буфером в 8М мочевине с pH 9,5 (оптимальном значении pH для хроматографической очистки гамма-интерферона). Нагрузка на сорбент может достигать 100 мг суммарного белка на мл носителя. Иммунный интерферон, имеющий изоэлектрическую точку выше 9,5, хорошо удерживается на сорбенте COOH-Биохром К-1, в то время как основная масса примесей обнаруживается в проскоке.

6. Сорбированные белки элюируют в градиенте концентрации хлористого натрия (от 0 до 1М). Фракции, содержащие по результатам гель-электрофореза целевой белок, объединяют и диализуют против 8М мочевины, pH 6.0.

7. Диализованный раствор иммунного интерферона наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1, уравновешенную 8М мочевиной, pH 6,0. Сорбировавшиеся белки элюируют в градиенте хлористого натрия (от 0 до 1М). Фракции, содержание гамма-интерферон, объединяют и диализуют против 2М мочевины в ацетате натрия, pH 6,0, затем против буфера без мочевины при pH 6,0.

Чистота продукта, определенная гель-электрофорезом в полиариламидном геле в полностью денатурирующих условиях, составляет не менее 98%. Белок после электрофореза обнаруживается в виде одной полосы с молекулярной массой около 17 кД без низкомолекулярных фрагментов. Этот белок дает положительную реакцию с моноклональными антителами к иммунному интерферону человека в Вестерн-блоте. Продукт элюируется одним пиком при обращенно-фазовой хроматографии на Octadecyl = Si100 Polyol в градиенте ацетонитрила в трифторуксусной кислоте. Противовирусная активность, определенная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита в монослойной культуре фибробластов легкого человека L68, составляет 2 • 10⁷ ед./мг. Выход готового продукта составляет около 12 мг из 20 г клеток (22-25% от содержания в исходном экстракте).

Сорбент COOH-Биохром К-1, удобный для масштабирования хроматографической стадии очистки белков, включая рекомбинатный иммунный интерферон человека, получают в результате сополимеризации метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита в н-бутаноле в присутствии динитрилазобисизомасляной кислоты в качестве инициатора. Для получения гранулированного сорбента реакционную смесь вводят при комнатной температуре в водный раствор хлористого натрия в присутствии поливинилового спирта при интенсивном перемешивании, затем смесь прогревают при 70^oC в течение 5 ч. По завершении реакции отмытые гранулы рассеивают на ситах, выделяя фракцию с размером 60 - 120 мкм, и определяют характеристики сорбента общепринятыми методами. Синтезированный по описанному способу катионообменник, получивший название COOH-Биохром К-1, имеет предел исключения по декстрану 5•10⁵D, полную обменную емкость 0,5 мг-экв/мл, адсорбционную емкость по бычьему сывороточному альбумину 110 мг/мл, объем порового пространства 0,5 - 0,6, pK кислотных групп от 5 до 6, максимальное рабочее давление - до 70 атм. Сорбент COOH-Биохром К-1 имеет сертификат для применения при очистке и выделении препаратов медицинского назначения, в том числе лекарственных препаратов.

Новым по сравнению со способом-прототипом является разобщение стадий разрушения клеток штамма-продуцента и солюбилизации целевого рекомбинантного белка, синтезирующегося в тельцах включения, что позволяет простым центрифугированием суспензии разрушенных клеток отделить от целевого продукта основную массу растворимых внутриклеточных белков и в дальнейшем для очистки использовать легко масштабируемую хроматографию на катионообменнике вместо дорогостоящего сорбента с моноклональными антителами. Использование низких концентраций (20 мМ) солей цинка и меди в среде для разрушения клеток позволяет избежать значительной протеолитической деградации белковой молекулы ИНФ-γ и в совокупности с эффективным процессом ренатурации рекомбинантного ИНФ-γ из раствора мочевины, более слабого денатурата чем гуанидинхлорид, обеспечивает высокий выход недеградированного целевого продукта.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурой графического изображения, где представлен электрофоретический анализ белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в процессе очистки рекомбинатного интерферона-гамма:
дорожка 1 - белок-маркер, мол. масса 14400;
дорожка 2 - клеточный экстракт штамма-продуцента E.coli MH-1 (pIFN-γ-trp2);
дорожка 3 - супернатант после центрифугирования клеточного экстракта;
дорожка 4 - осадок после центрифугирования клеточного экстракта (тельца включения);
дорожка 5 - отмывка телец включения 4М мочевиной;
дорожка 6 - раствор телец включения в 8М мочевине с 5М литием хлористым, pH 9,5;
дорожка 7 - обессоленный раствор телец включения;
дорожка 8 - препарат после первой хроматографической очистки;
дорожка 9 - препарат после второй хроматографической очистки.

Сущность предлагаемого изобретения раскрывается в следующих примерах.

Пример 1. Получение карбоксильного катионита COOH-Биохром К-1.

В стеклянной емкости на 500 мл готовят раствор метакриловой кислоты (23 ч) (70 мол %) и диметакрилата пентаэритрита (32 ч) (30 мол %) в н-бутиловом спирте (200 ч). В раствор вводят инициатор - динитрилазобисизомасляной кислоты (1,7 ч). В термостатируемый реактор, снабженный механической мешалкой, холодильником и трубкой для барботирования аргона, помещают раствор дистиллированной воды (700 ч), содержащий поливиниловый спирт (5 ч) и хлористый натрий (90 ч), и вводят реакционную смесь, приготовленную в стеклянной емкости, при непрерывном перемешивании со скоростью 300 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, далее включают обогрев реактора до 70^oC. Процесс сополимеризации проводят в течение 5 ч. Гранулы отмывают горячей дистиллированной водой от поливинилового спирта, затем изопропанолом - от мономеров и растворителя и дистиллированной водой от изопропанола. Гранулы рассеивают на ситах, выделяя фракцию с размером 60-120 мкм. Выход продукта составляет 96% от количества метакриловой кислоты, взятой в реакцию.

Катионит представляет собой сферические гранулы белого цвета и имеет следующие характеристики:
- предел исключения по декстранам 500 • 10³D;
- полная обменная емкость 0,5 мг-экв/мл;
- адсорбционная емкость по бычьему сывороточному альбумину 110 мг/мл;
- объем порового пространства 0,5 - 0,6;
- pK кислотных групп от 5 до 6;
- максимальное рабочее давление 70 атм.

Катиониту присвоено название COOH-Биохром К-1.

Пример 2. Получение высокоочищенного рекомбинантного иммунного интерферона человека.

Все процедуры проводят при 4^oC.

20 г биомассы E.coli MH1 [pIFN-γ-trp2] с содержанием иммунного интерферона (в виде нерастворимых тел включения) в количестве 10% от суммарного клеточного белка суспендируют в 40 мл 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 2 мМ ZnCl₂, 2 мМ CuCl₂ (буфер А) до получения однородной суспензии. Клетки разрушают ультразвуком при полной мощности излучателя (УЗДН-2Т) в течение 25-20 с (5 раз с 2-3-минутными интервалами между озвучиваниями) до снижения оптической плотности суспензии при 600 нм по меньшей мере в 2 раза. К смеси добавляют равный объем буфера А, гомогенизируют ее озвучиванием и центрифугируют в течение 30-60 мин при 10000 об/мин на центрифуге J2-21 в роторе JA-14. После центрифугирования супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий иммунный интерферон, заливают 100 мл 4М мочевины, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5, и гомогенизируют смесь озвучиванием в течение 25-30 с. Суспензию центрифугируют при 10000 об/мин 30-40 мин и собирают осадок, содержащий рекомбинантный гамма-интерферон.

Иммунный интерферон экстрагируют из осадка 100 мл 8М мочевины в 50 мМ трис-HCl, pH 9,5, 5M LiCl путем гомогенизации смеси озвучиванием в течение 20-30 с и последующего перемешивания в течение ночи. Суспензию центрифугируют 40 мин при 18000 об/мин, собирают супернатант, содержащий экстрагированные белки, и подвергают обессоливанию на Биогеле P2 (Bio-Rad, США; размер колонки 5 х 75 см) в 8М мочевине, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5. Фракции с рекомбинантным иммунным интерфероном, имеющие электропроводность менее 1 мСм, объединяют и наносят на колонку с COOH-биохромом К-1 (2 х 4 см, объем 12,6 мл), уравновешенную 8М мочевиной, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5. Колонку промывают до снижения оптической плотности элюата при 280 нм до исходного значения, затем элюируют сорбированные белки в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 1 М. Анализ фракций на содержание рекомбинантного иммунного интерферона проводят гель-электрофорезом белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях по [8]. Фракции, содержащие гамма-интерферон, объединяют и диализуют против 8М мочевины, 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение ночи. После диализа раствор наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1 (2 х 4 см), уравновешенную 8М мочевиной, 50 мМ ацетатом натрия, pH 6,0 и проводят хроматографию, как описано выше, но при pH 6,0. Собранный продукт диализуют последовательно против 2М мочевины, 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение 16 ч, затем против 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение 16 ч. Полученный продукт анализируют общепринятыми методами. Материальный баланс процесса представлен в табл. 1 (табл. 1-3 см. в конце описания).

Выход продукта составляет 615 мкг/г биомассы, чистота - не менее 98%, противовирусная активность, определенная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита в монослойной культуре клеток L68 человека, 2 • 10⁷ ед/мг. При гель-электрофорезе в полностью денатурирующих условиях белок проявляется в виде одной полосы с молекулярной массой порядка 17000Д, реагирующую с моноклональными антителами к иммунному интерферону человека в Вестерн-блоте.

Пример 3. Влияние концентрации хлористого лития на солюбилизацию рекомбинантного иммунного интерферона в растворах мочевины.

Подготовку и промывку тел включения рекомбинантного иммунного интерферона проводят как описано в примере 2. Осадок промытых тел включения, полученных из 10 г биомассы штамма-продуцента, суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, из суспензии отбирают пробы по 0,5 мл в пробирки для микроцентрифугирования и собирают осадок центрифугированием в течение 2 мин при 12000 об/мин. Осадок растворяют в 1 мл растворов мочевины и хлористого лития различной концентрации (см. таблицу 2) при pH 9,5 в течение 30 мин при комнатной температуре. Экстрагированные белки подвергают электрофорезу в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях, относительное содержание рекомбинантного иммунного интерферона человека определяют сканированием геля после окраски белка Кумасси ярко-голубым G250. Концентрацию белка в экстрактах определяют методом Лоури.

Результаты опыта представлены в таблице 2.

По результатам анализа для практического использования выбран раствор 6М LiCl в 6-8М мочевине, т.к. при указанной концентрации соли достигаются наибольший выход целевого продукта и его наибольшее содержание в экстракте.

Пример 4. Влияние pH на хроматографию рекомбинантного иммунного интерферона человека на катионите COOH-Биохром К-1.

Процедуру выделения рекомбинантного иммунного интерферона человека до стадии первой хроматографии проводят как описано в примере 2. Затем отбирают 5 проб обессоленного ИНФ-γ с содержанием белка 50 мг (содержание целевого белка 10%, т.е. 5 мг) и доводят pH раствора отдельных проб путем добавления раствора щелочи или кислоты до значения водородного показателя от 10,5 до 6,5. Подготовленные пробы наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1 (0,9 х 1,5 см, V=1 мл), уравновешенную соответствующим каждой пробе буферным раствором с 8М мочевиной. Колонку промывают до снижения оптической плотности элюата при 280 нм до исходного значения, затем элюируют сорбированные белки в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 1М в буфере с 8М мочевиной и соответствующим pH. Анализ фракций на содержание целевого белка проводят гель-электрофорезом белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях.

Результаты опытов представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что при pH 9,5 происходит наилучшая (в 7 раз) очистка целевого белка и с большим выходом (42,7%). При значениях pH выше и ниже 9,5 содержание интерферона -γ в элюате снижается, а также снижается и степень его очистки в ходе хроматографии на COOH-Биохроме К-1.

Таким образом, разрушение клеток штамма-продуцента, содержащего рекомбинантный целевой блок в тельцах включения, в водной среде и солюбилизации целевого белка после предварительного удаления растворимых клеточных белков позволяет использовать для получения высокоочищенного ИНФ-γ простую, хорошо воспроизводимую и легко масштабируемую 2-х стадийную хроматографическую очистку на катионообменнике COOH-Биохром К-1. Добавление в буфер для разрушения клеток небольших концентраций (20 мМ) солей цинка и меди позволяет избежать значительной протеолитической деградации ИНФ-γ и в совокупности с эффективным процессом ренатурации рекомбинантного белка из мочевины, более слабого денатуранта чем гуанидинхлорид, обеспечивает высокий выход недеградированного целевого продукта. Использование в способе доступного отечественного денатурирующего реагента и легко синтезируемого катионообменника позволяет успешно масштабировать процесс.

Литература
1. Патент США 4604284, кл. A 61 K 37/02, опубл. 05.08.86.

2. Патент США 4751078, кл. A 61 K 45/02, опубл. 14.06.88.

3. Патент США 4617378, кл. C 07 K 15/26, опубл. 14.10.86.

4. K. Sugumura, N.Higashi.//J.Bacteriol.-1988, v.170, N8, p. 3650-3654.

5. Патент США 4681930, кл. C 07 K 15/26, опубл. 21.07.87.

6. M.Matsubara, D.Nohara, Т.Sakai//Chem. Pharm.Bull., 1992, v.40, N2, p. 550-552.

7. E. D.Sverdlov, S.A.Tsarev, R.A.Krikbaev, I.P.Chernov, V.M.Rostapshov //FEBS Lett., 1987, v.212, p.233-236.

8. V.K.Laemmli //Nature (London), 1970, v. 227, p. 680-685.1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения интерферона. Рекомбинантный гамма-интерферон человека получают из нерастворимых тел включения клеток E.coli путем разрушения клеток штамма-продуцента в буферном растворе в присутствии солей цинка и меди, солюбилизации продукта смесью мочевины и хлористого лития и хроматографической очистки на катионообменнике СООН-Биохром К-1. Катионообменник представляет собой сополимер метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита. Способ позволяет легко масштабировать процесс выделения и очистки данного биологически активного вещества. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. Способ получения рекомбинантного интерферона-гамма человека из трансформированных клеток Escherichia coli, содержащих рекомбинантный иммунный интерферон в виде нерастворимых тел включения, предусматривающий разрушение клеток, экстрагирование интерферона-гамма, центрифугирование и хроматографическую очистку с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что клетки разрушают ультразвуком в присутствии солей цинка и меди, нерастворимые тела включения отделяют центрифугированием, экстрагирование интерферона-гамма проводят смесью мочевины и хлористого лития, а хроматографическую очистку осуществляют в две стадии на катионообменнике СООН-Биохром К-1, представляющем собой гранулированный сополимер метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита, при этом на первой стадии элюирование проводят при pH 9,5, а на второй - при pH 6,0. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстрагирование проводят 6-8М мочевиной в присутствии хлористого лития в концентрации 6М.