БИОПРЕПАРАТ ФИТОСПОРИН ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития фитопатогенных микроорганизмов.

В настоящее время известны биопрепараты, подавляющие развитие фитопатогенных бактерий (1), грибов (2,3). Однако неизвестны препараты на основе живых микробных культур, которые обладали бы одновременно высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов.

Наиболее близким к изобретению является препарат бактофит (4), основу которого составляет штамм Bacillus subtilis. Бактофит применяется для обработки огурцов защищенного грунта против грибных поражений, однако этот препарат не оказывает действия при бактериальных заболеваниях растений.

Задачей изобретения является создание биопрепарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными бактериями и грибами.

Поставленная задача решается применением препарата фитоспорин, который содержит в качестве основы культуру Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, характеризующуюся выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки B. subtilis ВНИИСХМ 128 и наполнитель,об.

Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10⁹ 1•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 92-98
Наполнитель 8 2
Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.

В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат и т.д. предпочтительно сахарозожелатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины).

Культура, составляющая основу биопрепарата характеризуется следующими свойствами:
B. subtilis ВНИИСХМ 128 грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Через 18 ч роста на МПА в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки с закругленными краями размером 1,9х0,5 мкм, расположенные одиночно, попарно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно эндоспоры, которые не раздувают клетку и расположены центрально. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-β-оксимасляной кислоты. При культивировании штамма на МПА, среде Громыко, сусло-агаре в течении 24 ч при 37^oC образуются складчатые колонии с изрезанным краем, вязкой консистенции, телесного цвета. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных условиях, не образует индол и сероводород. Не обладает лецитиназной, коагулазной, гиалуронидазной активностью.

Пример 1 На основе штамма B. subtilis ВНИИСХМ 128 с типичными морфологическими, культурными, биохимическими свойствами приготовлены пять вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата.

Вариант 1.

Препарат, содержащий, об%
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 0,5•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 92
Наполнитель (сыворотка крови КРС) 8
Вариант 2
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 94
Наполнитель (молоко) 6
Вариант 3
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 95
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 5
Вариант 4
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 1•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 97
Наполнитель (сыворотка крови КРС) 3
Вариант 5
Биомасса B. subtilis ВНИИСХМ 128 5•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 98
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 2
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы, высушивали лиофильно, ампулы запаивали.

Проверяли безвредность для животных полученных вариантов препарата, а также специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп фитопатогенных бактерий и грибов.

Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 16 18 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 (для изучения активности в отношении бактериальных тест-культур) и на картофельный агар (для исследования антагонистической активности в отношении тест-культур грибов). Посевы инкубировали в термостате при 28^oC в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур бактерий и суспензии грибных спор в физиологическом растворе). Чашки с тест-культурами бактерий инкубировали в термостате при 37^oC в течение 18 ч, с грибными тест-культурами при 28^oC в течение 5 сут. Учет результатов проводили по величине зон подавления роста тест-культур. Контролем роста тест-кукльтур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 и картофельным агаром без культуры-антагониста.

Полученные данные в результате испытаний представлены в табл. 1.

Как видно из представленных в таблице данных, оптимальные количества живых микробных клеток B. subtilis ВНИИСХМ 128 в 1 мл физиологического раствора составляют 1•10⁹ 1•10¹⁰ клеток при их объемном содержании 92-98% Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата фитоспорин безвредны для животных и характеризуются специфической антагонистической активностью в отношении тест-культур фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому предлагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются.

Пример 2. Препарат фитоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов (табл. 2 и 3).

Пример 3. Фитоспорин безвреден для лабораторных животных. Введение препарата животным различными способами даже в значительных дозах не вызывает гибели и патологических изменений внутренних органов. Результаты исследования безвредности штамма B. subtilis ВНИИСХМ 128, составляющего основу препарата, представлены в табл. 4.

Пример 4. Препарат фитоспорин применен для защиты растений от бактериальных и грибных болезней. Вегетационный опыт проводили в гончарных вазонах емкостью 3 л с почвенно-песчаной смесью. Повторность опыта пятикратная. Глубина заделки семян, густота всходов соответствует видовым особенностям каждого растения. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% от полной влагоемкости. Семена пшеницы сорта "Мироновская 808", ячменная сорта "Ида", гороха сорта "Уладовский" замачивали 12 ч в суспензии фитоспорина из расчета 1 доза препарата (1•10⁹ живых микробных клеток) в 1 мл водопроводной воды. В контроле семена замачивали в водопроводной воде. Учет поражаемости корневыми гнилями и фузариозным увяданием зерновых проводили в фазу колошения, а для гороха в фазу цветения. Результаты представлены в табл. 5.

Изучали также эффективность фитоспорина для защиты голосеменных растений от фузариоза корневой шейки. Семена растений замачивали в течении 18 ч в суспензии фитоспорина (из расчета 1 доза препарата в 1 мл водопроводной воды). Затем семена высевали в сильнозараженную почву теплиц с пленочным покрытием. В табл. 6 представлены результаты проведенных испытаний.

Таким образом фитоспорин может быть использован в качестве средства защиты растений от фитопатогенных бактерий и грибов.

Литература
1. Кузнецова М.А. Филиппов А.В. Ризоплан и фитофтороз картофеля // Защита растений, 1995, N 8, с. 19-20.

2. Биофунгицидный споровый препарат против фузариозов кукурузы // Авторское свидетельство СССР N 256150.

3. Средство профилактической защиты семян, клубней и наземных частей растений, содержащее Bacillus subtilis IBE 711 и его метаболиты с повышенной фунгицидной активностью // Авторское свидетельство СССР N 262504.

4. Список химических и биологических средств борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками, регуляторов роста и феромонов, разрешенных для применения в сельском, в том числе фермерском, лесном и коммунальном хозяйствах на 1992-1996 г. // Защита растений. 1993, N 3, с. 68-72.

Использование: биотехнология, производство биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов. Сущность изобретения: биопрепарат фитоспорин содержит штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, с концентрацией клеток 1•10⁹ - 1•10¹⁰ клеток в 1 мл физиологического раствора в количестве 92 - 98 об.% и наполнитель в количестве 2 - 8 об.%. Вышеуказанный штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов и может быть использован для защиты различных видов растений, в частности сельскохозяйственных, декоративных, древесных. Фитоспорин является экологически чистым препаратом и безвредным как для растений, так и для теплокровных. 6 табл.

Биопрепарат для защиты растений от болезней, включающий живую биомассу бактерий Bacillus subtilis и наполнитель, отличающийся тем, что он содержит биомассу штамма бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 при следующем соотношении компонентов, об.

Биомасса штамма бактерий B. subtilis ВНИИСХМ 128 (1 • 10⁹ 1 • 10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора) - 92 98
Наполнитель 2 8о