Штамм бактерий Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 " ингибитор роста фитопатогенных грибов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A01N63/20 C12R1/125 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для защиты растений от фитопатогенных грибов.

Штамм Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 может использоваться в качестве эффективного средства для защиты от фитопатогенных микроорганизмов, как самостоятельного компонента, так и в композиции с другими агрономически полезными микробами для повышения продуктивности растений.

Известен штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, составляющий основу биопрепарата «Фитоспорин» для защиты растений от болезней [патент RU 2099947 C1. Биопрепарат фитоспорин для защиты растений от болезней. МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1/125. Заявка № 96121980/13 от 15.11.1996, опубл.: 27.12.1997], с концентрацией микробных клеток 10⁹-10¹⁰ в 1,0 мл физраствора в количестве 92-98% и наполнитель в количестве 2-8 об. %.

Известен штамм Bacillus subtilis 8А, депонированный под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, в качестве средства повышения продуктивности растений и защиты от фитопатогенных микроорганизмов [патент RU 2495119 C1. ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 8A В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МПК C12N 1/20, C12R 1/125, A01N 63/00. Заявка № 2012151104/10 от 29.11.2012, опубл.: 10.10.2013 в Бюл. № 28].

Однако отсутствуют данные об ингибирующем действии на другие агрономически полезные микроорганизмы, что не позволяет сделать окончательного заключения о возможности их использования в составе комплексных микробиологических препаратов.

Задачей изобретения является установление штамма для возможного его использования в сельском хозяйстве как средства защиты от фитопатогенных грибов, позволяющего расширить перечень подобных штаммов микробов-антагонистов, и возможного компонента в композиции с другими агрономически полезными штаммами микроорганизмов при создании биоудобрений.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства защиты от патогенных грибов, как самостоятельного компонента, так и в композиции с другими агрономически полезными микроорганизмами при создании биоудобрений, обеспечивающих повышение продуктивности сельскохозяйственных растений, предлагается использовать штамм эндофитных бактерий Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389, что позволит расширить номенклатуру микробов-антагонистов фитопатогенных грибов, используемых в растениеводстве.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

При выращивании на плотной питательной среде на основе FT-агара через 24 часа культивирования при температуре (37±1)°C образует однородные, округлые колонии мягкой консистенции, плоские, бежевого цвета с волнистым краем. В жидкой тиогликолевой среде наблюдается равномерное помутнение среды с рыхлым осадком на вторые сутки. При микроскопии мазков, окрашенных по Граму, наблюдаются грамположительные спорообразующие прямые палочки с закругленными краями, расположенные отдельно. Культура штамма образует споры, которые при окрашивании по Шефферу-Фултону расположены внутри микробных клеток в периферической части.

Физиолого-биохимические свойства

Штамм обладает способностью к росту при температуре от 10°C до 37°C в аэробных условиях, оптимум при температуре (32÷37)°C и pH (6,0÷7,0). Продолжительность культивирования на плотной питательной среде (FT-агар) - (24÷48) часов, жидкой питательной среде (тиогликолевая среда) - (48÷72) часа.

Штамм образует желатиназу, каталазу, протеазы, амилазу, редуцирует нитраты, обесцвечивает метиленовую синь.

Штамм чувствителен к следующим антибиотикам: норфлоксацину, амикацину, спарфлоксацину, тобрамицину, азитромицину, рокситромицину, рефампеницилину, налидиксовой кислоте, левомицетину, имипенему, цефтриаксону, цефтоксиму, ампициллину, цефуроксиму и нетилмицину.

Штамм не обладает патогенностью для человека и животных согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах С.Н.1.3.2322-08. Поддержание и хранение штамма осуществляет в лиофилизированном состоянии при температуре (2÷6)°C в течение 24 месяцев.

Для поддержания свойств штамма проводится высев исходной культуры на плотную питательную среду (FT-агар) в чашках по методу Дригальского, для последующего отбора наиболее типичных колоний для дальнейшего накопления. С этой целью осуществляют пересев отобранных колоний на плотную питательную среду (FT-агар), скошенную в пробирках и матрацах. Культуру, выращенную на скошенной плотной питательной среде в матрацах, смывают средой высушивания, фасуют во флаконы и подвергают лиофильной сушке. Полученную сухую культуру закладывают на последующее хранение. При необходимости приготовления биомассы сухую культуру ресуспендируют физиологическим раствором и полученную суспензию микробных клеток используют для дальнейшего их накопления, в соответствии с разработанной технологией.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма BS2017 ВКПМ B-13389

Штамм Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 выделен из ассоциации почвенных микроорганизмов путем последовательных пересевов культур на плотной питательной среде (FT-агар) после инкубирования культур в течение 48 часов при температуре 32°C. Высев проводили по методу Дригальского на 6 последовательных чашек. В результате проведенных операций была выделена культура BS2017, обладающая культурально-морфологическими, биохимическими признаками, способностью к спорообразованию, присущими роду Bacillus. Дальнейшие исследования были проведены совместно со специалистами ФГУП ГосНИИГенетика, в которые были отправлены для проведения токсанометрической идентификации на основании молекулярно-генетического анализа «чистые» агаризованные культуры выделенного изолята. Идентификация штамма BS2017 до вида с использованием анализа сиквенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК (99%), а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров позволили отнести тестируемый штамм к виду Bacillus subtilis.

Результат проведенных экспериментальных исследований определили целесообразность депонирования штамма Bacillus subtilis BS2017 во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером B-13389.

Пример 2. Приготовление посевного материала и прототипа биопрепарата (компонента биопрепарата) на основе микробных клеток Bacillus subtilis штамма BS2017 ВКПМ B-13389.

Лиофильно высушенную культуру Bacillus subtilis ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия и высевали на плотную питательную среду FT-агар, скошенную в пробирках, содержащую (г/дм³):

сернокислотный гидролизат рыбной муки 17,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 5,0; экстракт пекарских дрожжей 2,3; MgSO₄•7H₂O 0,5; Na₂ SO₄ 0,7; цистеин 0,5; агар 15,0; дистиллированная вода до 1,0 дм³.

Посевы инкубировали при температуре (30±2)°C в течение 46÷50 часов. Выращенную на скошенной плотной питательной среде в пробирках микробную культуру смывали 0,9% раствором хлорида натрия и готовили посевной материал с концентрацией 1,0×10⁹ КОЕ в 1,0 см³.

Приготовленную бактериальную суспензию вносили в количестве 15,0 см³ в колбу емкостью 500,0 см³, содержащую 150,0 см³ жидкой питательной среды Федорова состава (г/дм³):

калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5; магний сернокислый 0,3; хлорид натрия 0,3; железо сернокислое 0,005; марганец сернокислый 0,005; карбонат кальция 3,5; меласса 30,0; борная кислота 0,005; дистилированная вода до 1,0 дм³. pH (7,2±0,2)

Полученные посевы выращивали при температуре (32±1)°C в течение (46÷50) часов в шейкер-инкубаторе с частотой вращения (250±2) оборотов в минуту.

Полученную нативную культуру, содержащую не менее 1,0×10⁹ КОЕ в 1,0 см³, использовали в качестве прототипа биологического препарата (прототипа компонента биологического препарата) для оценки ингибирующего действия в отношении грибов рода Fusarium и изучения антагонистической активности в отношении агрономически полезных микроорганизмов.

Пример 3. Исследование ингибирующего действия штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 в отношении грибов рода Fusarium.

Объектом проводимых исследований являлся штамм Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389, выращенный на жидкой питательной среде Федорова.

В качестве тест-объектов использовали мицелиальные грибы из коллекции ФГБНУ Федеральный научный аграрный центр Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого, вызывающие корневые гнили бобовых. Для хранения культур грибов использовали агаризованную среду Чапека и картофельно-глюкозный агар.

При изучении фунгицидной активности штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 определяли его фунгистатическое действие в опытах in vitro на фитопатогенные грибы Fusarium oxysporum и F. gibbosum. Активность антагониста в отношении грибов оценивали в соответствии с ОФС 1.2.4.0010.15 «Определение антимикробной активности методом диффузии в агар». Суспензию спор грибов каждого вида тест-штаммов смывали стерильной водой с колоний 10 суточного возраста (100,0 мкл при плотности спор 10⁶ спор/мл) и распределяли по поверхности среды в чашках Петри на картофельно-глюкозном агаре. Далее на поверхность агара производили посев биомассы антагониста уколом. Чашки Петри с посевами инкубировали при температуре (28±1)°С в течение 72 и 144 часов. При оценке результатов учитывали наличие и интенсивность роста патогенных грибов. С этой целью измеряли диаметр зон ингибирования роста грибного мицелия. Также фунгицидное действие оценивали по величине диаметра зоны задержания роста грибов вокруг колоний штамма.

Результаты фунгистатического действия штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 на исследуемые культуры фитопатогенных грибов отражены в таблице.

Активность штаммов Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 в отношении Fusarium oxysporum и F. gibbosum носит выраженный фунгистатический и фунгицидный эффекты, которые проявляются не только в задержке роста мицелия фитопатогенных грибов, но и в увеличении диаметра зон подавления роста (см. таблицу).

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что уровень подавления фитопатогенных микромицетов штаммом Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 сравним с эффективностью действия ранее полученных высокоактивных антагонистических штаммов B. subtilis, например, B. subtilis Б-046.

Пример 4. Оценка антагонистической активности штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389 в отношении агрономически полезных микроорганизмов.

Объектом проводимых исследований являлся штамм Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ B-13389, выращенный на жидкой питательной среде Федорова.

В качестве тест-объектов использовали агрономически полезные культуры штаммов Bacillus megatherium var. phosphaticum RCAM03190 и Bradyrhizobium japonicum (Kirchner) Jordan CSAU R2901, выращенные на плотной питательной среде «FT-агар».

Штамм Bradyrhizobium japonicum является клубеньковой бактерией, способной использовать атмосферный азот в симбиозе с бобовыми растениями.

Штамм Bacillus megatherium var. phosphaticum является мобилизатором труднорастворимых фосфатов почвы, так как обладает фосфат разлагающими свойствами.

Антагонистическую активность оценивали диффузионным методом с использованием перпендикулярных штрихов. С этой целью на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри с применением бактериологической петли высевали культуру Bacillus subtilis BS2017 сплошной чертой по её диаметру. Посев инкубировали в термостате при температуре (30±1)°С в течение 24 часов. Через указанное время перпендикулярно от края чашки к штриху, но не касаясь его, бактериологической петлей на поверхность плотной питательной среды наносили культуры Bacillus megatherium var. phosphaticum и Bradyrhizobium japonicum (Kirchner) Jordan. Чашку Петри с плотной питательной средой, засеянную тест-культурами и оцениваемым штаммом, инкубировали в термостате при температуре (30±1)°С в течение 2 суток. Результаты проверки антагонистической активности методом перпендикулярного штриха, представленные на чертеже, где 1 - Bacillus subtilis, 2 - Bradyrhizobium japonicum; 3 - Bacillus megatherium, свидетельствуют об отсутствии зоны ингибирования роста культур на границе их посевов, что позволяет сделать заключение, что изученные штаммы не обладают взаимной антагонистической активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis BS2017, обладающий фунгистатической и фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов Fusarium, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика под номером B-13389. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов микробов-антагонистов фитопатогенных грибов для использования в сельском хозяйстве. 1 ил., 1 табл., 4 пр.

Штамм Bacillus subtilis BS2017, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика под номером B-13389 – ингибитор роста патогенных грибов Fusarium.