БИОПРЕПАРАТ ФИТОСПОРИН ЖИДКИЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития фитопатогенных грибов и бактерий.

В настоящее время создан биопрепарат Фитоспорин сухой на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26 ВНИИСХМ 128 для защиты растений от комплекса болезней (патент N 2099947) (1).

Препарат содержит живые клетки и споры В. subtilis и наполнитель. Препарат разлит в стерильные ампулы, лиофильно высушен и запаян. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат, сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при лиофильном высушивании препарата.

Однако, недостатком предложенной формы биопрепарата Фитоспорина - сухой порошок в ампулах, является:
1) необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для лиофильной сушки, а сам период сушки довольно длителен (50-80 ч);
2) неудобство использования ампул с препаратом для приготовления больших объемов рабочих разведении препарата перед их применением для обработки растений;
3) препарат содержит только биомассу антагонистически активного штамма В. subtilis 26Д и не содержит готовые антибиотические вещества, обладающие литической активностью в отношении патогенных грибов, которые продуцируются бактериальными клетками в процессе культивирования и содержатся в культуральной жидкости.

Задачей изобретения является создание новой формы биопрепарата Фитоспорин, менее дорогостоящей, удобной в использовании, содержащей готовые антибиотические вещества для защиты растений от болезней, вызываемых бактериями и грибами.

Поставленная задача решается получением биомассы штамма Bacillus subtilis 26 путем гомогенного глубинного культивирования в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, органический источник азота (пептон или триптон) и углеводы.

Глубинное культивирование осуществляют при 37-50^oC при насыщении среды кислородом в пределах 60-70% и перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин. Контроль за ростом культуры проводят путем отбора проб через каждые 2 часа и определении концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности и на ФЕК 56М, наличие спор определяют в мазках культуры, окрашенных по Грамму, антибиотическую активность культурального фильтрата определяют путем ее добавления к тестовым штаммам культур фитопатогенных грибов и оценивают по снижению оптической плотности в единицах литической активности (2).

Культивирование проводят в течение 12-16 часов. Полученная культуральная жидкость, содержит 15-25 млрд кл/мл (70-100% спор) и антибиотические вещества, за счет чего усиливается специфическая активность жидкого препарата Фитоспорина. К полученной биомассе добавляется стабилизатор биомассы гуми 0,5-2%, что обеспечивает сохранение количества живых колониеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 месяцев.

Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу штамма В. subtilis 26, антибиотические вещества, обеспечивающие литическую активность и стабилизатор биомассы используется в качестве бактерийного препарата Фитоспорин в жидкой форме.

Использование гуми, как стабилизатора биомассы препарата Фитоспорин, улучшает его свойства в качестве сельскохозяйственного препарата за счет обогащения гуминовыми кислотами, полезными для почвообразования (3).

Препарат содержит живые клетки В. subtilis ВНИИСХМ 128, антибиотические вещества и стабилизатор, об.%:
Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128 - (15-20)•10⁹
Живых микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости - 98,5-97
Стабилизатор - 0,5-2
Антибиотические вещества : литическая активностью - 100-200 ЕД
Необходимость стабилизатора обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при хранении препарата в течение 6-8 месяцев.

Пример 1. На основе штамма В7 subtilis ВНИИСХМ 128 с типичными морфологическими и культуральными признаками и биохимическими свойствами приготовлены 6 вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток и разной концентрацией стабилизатора.

Вариант 1.

Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 10•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 98,9
Стабилизатор биомассы - гуми - 0,1
Вариант 2.

Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 15•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 98,9
Стабилизатор биомассы - гуми - 0,1
Вариант 3.

Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 20•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 98,5
Стабилизатор биомассы - гуми - 0,5
Вариант 4.

Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 25•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 98
Стабилизатор биомассы - гуми - 1
Вариант 5.

Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 20•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 97
Стабилизатор биомассы - гуми - 2
Вариант 6.

Биомасса В. subtilis ВНИИСХМ 128, - 20•10⁹
Живых клеток в 1 мл культуральной жидкости - 96
Стабилизатор биомассы - гуми - 3
Литическая активность культуральной жидкости во всех вариантах препарата составляла 100-200 ЕД.

Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные емкости на 10 л.

В изготовленных препаратах оптимальные количества бактериальных клеток В. subtilus ВНИИСХМ 128 в 1 мл культуральной жидкости составили 15•10⁹ - 25•10⁹ при их объемном содержании 98,9-96%. Оптимальное содержание стабилизатора - гуми было 0,5-2%.

Полученные варианты препарата проверяли на безвредность для животных, а также специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп фитопатогенных бактерий и грибов.

Для определения безвредности содержимое каждого варианта препарата в объеме 1 мл вводили перорально мышам. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 16-18 г. Препарата считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение 5 суток наблюдения. Результаты испытаний представлены в табл. 1 (см. в конце описания)
Испытания показали, что все варианты препарата Фитоспорина жидкого безвредны. Все животные остались живыми в течение периода наблюдения, ни у одного из них не выявлены признаки заболеваний, первоначальная масса животных увеличилась.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур фитопатогенных бактерий и грибов.

Исследование проводили методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 (для изучения активности к бактериальным тест-культурам) и на картофельный агар (для изучения антагонистической активности к тест-культурам грибов). Посевы инкубировали в термостате при температуре 28^oC в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихами тест-микроорганизмы (500 млн суспензий суточных культур тест-бактерий и суспензии спор грибов в физиологическом растворе). Чашки с тест культурами бактерий инкубировали при температуре 37^oC в течение 18 часов, с тест-культурами грибов - при 28^oC в течение 5 суток. Учет результатов опытов проводили по величине зон подавления роста тест-культур. Контролем служили тест-культуры, параллельно выращенные на чашках Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 и картофельным агаром без культуры антагониста. Результаты испытаний представлены в табл. 2 и 3 (см. в конце описания).

Полученные данные показывают, что исследованные варианты препарата Фитоспорин жидкий безвредны для животных и характеризуются специфической антагонистической активностью в отношении тест-культур фитопатогенных микроорганизмов.

Для изучения срока годности препарата Фитоспорин жидкий, серии препарата, изготовленные в 1997 году были заложены на хранение и подвергались переконтролю на содержание живых колониеобразующих клеток через каждые 2 месяца. Количество живых колониеобразующих клеток (КОЕ) определяли высевом на плотные питательные среды: Гаузе 2 или картофельный агар и подсчетом выросших колоний.

В табл. 4 представлены данные контроля 6 вариантов препарата Фитоспорин жидкий.

Как следует из данных таблицы, при использовании стабилизатора биомассы, живые микробные клетки в препарате сохраняются.

Использованные источники информации
1. Менликеев М.Я., Смирнов В.В., Байгузина Ф.А. и др. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней / Патент N 2099947, RU, C 12 N /20, опубл 25.12.97, бюл N 12.

2. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Авиженис В.Ю. Технология производства лизосубтилина ГЗ Х // Тезисы докладов ВНИИИ биосинтеза белковых веществ. - 1974. - Вып. 2. - С. 77-83.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к биопрепаратам, используемым для защиты растений от болезней. Биопрепарат Фитоспорин жидкий является культуральной жидкостью, содержащей 15-25 млрд кл/мл эндофитной бактерии Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д), антибиотические вещества с литической активностью 100-200 ЕД/мл , вызывающие лизис фитопатогенных грибов и бактерий. Добавление стабилизатора в препарат и стабилизатор биомассы - гуми 0,5 - 2% обеспечивает сохранение количества живых колонеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 месяцев и улучшает его свойства за счет обогащения гуминовыми кислотами, полезными для почвообразования. 4 табл.

Биопрепарат фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней, содержащий живые микробные клетки и споры бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д), отличающийся тем, что количество живых микробных клеток в 1 мл препарата составляет 15 - 25 млрд и он содержит антибиотические вещества с литической активностью 100 - 200 ЕД в 1 мл и стабилизатор биомассы - гуми 0,5 - 2%.