БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2003 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития фитопатогенных грибов и бактерий.

В настоящее время созданы биопрепараты, подавляющие фитопатогенные грибы и, частично, бактерии. Известен препарат бациспецин БМ [1], основу которого составляет штамм Bacillus subtilis. Этот препарат применяется для защиты злаков от возбудителей корневой гнили, бурой и карликовой ржавчины, но спектр его действия очень узкий.

Наиболее близким к заявляемому препарату является препарат Фитоспорин на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26 ВНИИСХМ 128 для защиты растений от комплекса болезней [2]. Однако еще не известны биопрепараты, которые обладали бы высокой активностью против фитопатогенных грибов и бактерий-возбудителей наиболее вредоносных болезней сельскохозяйственных растений, в том числе плодово-ягодных культур.

Задачей изобретения является создание биопрепарата для защиты растений от комплекса болезней, вызываемых грибами и бактериями.

Поставленная задача решается применением биопрепарата, который содержит в качестве основы живые клетки и споры бактерии Bacillus subtilis 11 Б, депонированной под номером ВКМ В-2218 Д, обладающей выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий.

Препарат содержит живые клетки В.subtilis ВКМ В-2218 и наполнитель, об. %:
биомасса В.subtilis ВКМ В-2218 Д - 1•10⁹-5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости 94-99,5,
стабилизатор: гуми 0,5-2,0 или сульфид натрия 2,0-6,0.

Стабилизатор биомассы (гуми или сульфид натрия) обеспечивает сохранение количества живых колонеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 месяцев. Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу штамма В.subtilis BKM В-2218 Д и стабилизатор биомассы, используется в качестве бактерийного препарата в жидкой форме.

Культура, составляющая основу биопрепарата, характеризуется следующими свойствами: В.subtilis BKM В-2218 Д - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу, на мясопептонном агаре (МПА), сусло-агаре дают обильный рост, на МПА образуют серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки и осадка. Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 2-3х0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. Клетки подвижны. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, размер 0,9х0,6 мкм, расположены в клетке эксцентрично.

Культура ферментирует глюкозу, в-галактозу, лактозу, сахарозу и мальтозу. Не разлагает маннит, инозит, сорбит и арабинозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат натрия с глюкозой, пропионат и малонат натрия не использует, слабо растет в анаэробных условиях. Характеризуется наличием аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, отсутствием фенилаланилдезамилазы, орнитиндекарбоксилазы. Образует ацетилметилкарбинол. Редуцирует нитраты, не образует газ на среде с нитратами в анаэробных условиях. Не образует индол и сероводород.

Пример. На основе штамма В.subtilis BKM В-2218 Д с типичными морфологическими и культуральными признаками и биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток.

Препарат содержит
Вариант 1:
биомасса В.subtilis BKM В-2218 Д живых клеток в 1 мл - 1,0•10⁹
стабилизатор гуми - 0,5 об.%
Вариант 2:
биомасса В.subtilis BKM В-2218 Д живых клеток в 1 мл - 2•10⁹
стабилизатор гуми - 1,0 об.%
Вариант 3:
биомасса В.subtilis BKM В-2218 Д живых клеток в 1 мл - 3•10⁹
стабилизатор гуми - 2,0 об.%
Вариант 4:
биомасса В.subtilis BKM В-2218 Д живых клеток в 1 мл - 5•10⁹
сульфид натрия - 2,0 об.%
Вариант 5:
биомасса В.subtilis BKM В-2218 Д живых клеток в 1 мл - 10•10⁹
сульфид натрия - 6,0 об.%
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные флаконы по 500 мл, закрывали резиновыми пробками и завальцовывали алюминевыми колпачками.

В изготовленных препаратах оптимальные количества бактериальных клеток В. subtilis BKM В-2218 Д в культуральной жидкости составили 1•10⁹-5•10⁹ при их объемном содержании 94-99,5%. Дальнейшее повышение концентрации микробных клеток существенно не отражается на качестве препарата.

Полученные варианты препарата проверяли на безвредность для животных, а также специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп фитопатогенных бактерий и грибов.

Для определения безвредности 1 мл препарата с разным содержанием микробных клеток вводили перорально мышам. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 16-18 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми. Результаты наблюдений представлены в таблице 1.

Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности препарата.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур фитопатогенных бактерий и грибов. Исследование проводили методом отсроченного антагонизма. Для этого микробную взвесь препарата высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 (для изучения активности к бактериальным тест-культурам) и на картофельный агар (для изучения антагонистической активности к тест-культурам грибов). Посевы инкубировали в термостате при температуре 28^oС в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихами тест-микроорганизмы (500 млн. суспензий суточных культур тест-бактерий и суспензии спор грибов в физиологическом растворе). Чашки с тест-культурами бактерий инкубировали при температуре 37^oС в течение 18 часов, с тест-культурами грибов - при 28^oС в течение 5 суток. Учет результатов опытов проводили по величине зон подавления роста тест-культур. Контролем служили тест-культуры, параллельно выращенные на чашках Петри с агаризованной средой Гаузе N 2 и картофельным агаром без культуры антагониста. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Полученные данные показывают, что исследованные варианты препарата на основе штама В.subtilis ВКМ В-2218 Д характеризуются специфической антагонистической активностью в отношении тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий.

Следовательно, эффективность штамма, входящего в состав препарата, и предполагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются в тестах задержки роста фитопатогенов.

Полученные данные показывают возможность применения препарата в качестве средства защиты растений от бактериальных и грибных болезней овощных, зерновых и плодово-ягодных культур.

Источники информации
1. Вялых Л.К., Мелентьев Л.И. Индукция устойчивости к ржавчине у ячменя и пшеницы, вызываемая препаратом Бациспецин БМ. / Микробиол. охрана биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия: Тез. докл. Всес. симп. - Оренбург, 1991. - С.23 и 24.

2. Менликеев М.Я., Смирнов В.В., Байгузина Ф.А. и др. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней. / Патент N 2099947, RU, C 12 N 1/20, опубл. 25.12.97, бюл. N 12.

Изобретение относится к сельскохозяйственному производству, в частности к защите растений от болезней, и касается биопрепарата для защиты растений от грибных и бактериальных болезней. Биопрепарат создан на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis BKM В-2218 Д, обладающей высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям грибных и бактериальных болезней овощных, зерновых и плодово-ягодных культур. Биопрепарат содержит биомассу Bacillus subtilis BKM В-2218 Д при следующем соотношении компонентов, об. %: биомасса Bacillus subtilis BKM В-2218 Д - живых микробных клеток - (1-5)x10⁹ в 1 мл культуральной жидкости 94-99,5, стабилизатор гуми 0,5-2,0 или сульфид натрия 2,0-6,0. Предложенный биопрепарат позволяет защитить растения от комплекса болезней, вызываемых грибами и бактериями. 2 табл.

Биопрепарат для защиты растений от грибных и бактериальных болезней, включающий живую микробную массу Bacillus subtilis BKM В-2218 Д и стабилизатор, отличающийся тем, что он содержит биомассу B.subtilis BKM В-2218 Д при следующем соотношении компонентов, об.%: биомасса Bacillus subtilis BKM В-2218 Д - живых микробных клеток - (1-5)•10⁹ в 1 мл культуральной жидкости 94-99,5 и стабилизатор гуми 0,5-2,0 или сульфид натрия 2,0-6,0.