СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/84 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения содержания хлорида натрия в поте при диагностике муковисцидоза.

Муковисцидоз - одно из наиболее часто встречающихся наследственных заболеваний, вызываемое мутацией гена трансмембранного регулятора (1). Это заболевание характеризуется поражением экзокринных желез жизненно важных органов и систем и имеет тяжелое течение и прогноз особенно при позднем выявлении.

Ранняя скриннинговая диагностика муковисцидоза, проводимая как правило у детей первого года жизни, позволяет значительно увеличить количество выявленных больных, что приводит к возрастанию продолжительности их жизни в результате своевременного назначения адекватного лечения. Однако это требует разработки безопасных, простых в исполнении и точных методов диагностики.

Характерным проявлением муковисцидоза является нарушение функционирования хлоридного канала клеточных мембран, что приводит к резкому возрастанию концентрации хлорида натрия в поте, диссоциирующего на эквивалентное количество анионов хлорида и катионов натрия. Это явление было положено в основу метода диагностики данного заболевания. Так, у здоровых детей содержание хлорида натрия, определенное по концентрации анионов хлорида в поте не превышает 30-40 мМ/л, в то время как у детей с муковисцидозом оно достигает 50-60 мМ/л, как правило не превышая 150 мМ/л (2).

Стандартным способом диагностики муковисцидоза является анализ содержания хлорида натрия по концентрации анионов хлорида в поте титрованием нитратом серебра в присутствии индикатора, реагирующего на избыток ионов серебра (3).

Существенным недостатком известного способа является необходимость проведения анализа в лабораторных условиях, неудовлетворительная воспроизводимость, связанная с визуальным контролем конечной точки титрования и нестабильностью при хранении титранта (раствора нитрата серебра), что требует постоянного определения его концентрации. Это также усложняет анализ и увеличивает его продолжительность до 30-40 мин.

Наиболее близок к предлагаемому способу способ диагностики муковисцидоза путем определения содержания хлорида натрия по концентрации катионов натрия в поте обработкой пробы пота слабокислотными катионитами в кислотной форме. При этом катионы натрия, составляющие свыше 95% всех содержащихся в поте катионов, вытесняют из фазы катионита в раствор эквивалентное количество протонов, которые затем легко определяются в присутствии кислотно-основного индикатора (4).

Существенным недостатком известного способа является неудовлетворительная воспроизводимость, т.к. полнота протекания реакции ионного обмена на слабокислотных катионитах зависит от значения pH пота. Чем выше pH, тем полнее протекает реакция, т.е. предлагаемый способ дает воспроизводимые результаты лишь при анализе проб пота с низким содержанием органических кислот. Кроме того, в области pH близких к нейтральным, скорость установления равновесия ионообменной реакции для слабокислотных катионитов резко падает, что увеличивает продолжительность анализа до 40-60 мин.

Целью данного изобретения является разработка точного и быстрого метода определения содержания хлорида натрия в поте по концентрации катионов натрия. Предлагаемый способ заключается в том, что пробу пота обрабатывают сильнокислотными катионитами в кислотной форме. Предварительно сильно кислотные катиониты в кислотной форме отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, высушивают при 120^oC до постоянной массы и затем измельчают до порошкообразного состояния. Подготовленные таким образом катиониты хранят в сухом виде и используют по мере необходимости. Количество катионита, применяемого для анализа, рассчитано исходя из максимально возможного содержания хлорида натрия в поте и составляет 1-1,5 мг на пробу.

Предлагаемый способ позволяет значительно повысить точность определения концентрации катионов натрия в поте, так как степень протекания реакции обмена протона на катион натрия на сильнокислотных катионитах практически не зависит от присутствия органических кислот. Кроме того, для сильнокислотных катионитов характерна высокая скорость реакции ионного обмена, что позволяет уменьшить продолжительность проведения анализа по сравнению с прототипом в 5-7 раз.

Способ иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1. В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 1 мг измельченного сульфокатионита марки КУ-23 в кислотной форме зарядки, представляющего собой сульфированный макропористый сополимер стирола и дивинилбензола с содержанием сульфогрупп 5,1 мМ/г, добавляют 1 каплю 0,1% раствора метилового красного в 60% этаноле и 20 мкл пота пациента. Смесь перемешивают, через 2 минуты спектрофотометрически определяют оптическую плотность и находят концентрацию хлорида натрия по калибровочной кривой.

Содержание хлорида натрия в поте составляет 34,1 мМ/л, определенное титрованием нитратом серебра 32,3 мМ/л. Пример 2. В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 1,5 мг измельченного фосфоновокислотного катионита марки СФ-5 в кислотной форме зарядки, представляющего собой фосфорилированный макропористый сополимер стирола и дивинилбензола с содержанием фосфоновокислотных групп 4,7 мМ/г, добавляют 1 каплю 0,1% раствора метилового красного в 60% этаноле и 20 мкл пота больного муковисцидозом. Смесь перемешивают, через 4 минуты спектрофотометрически определяют оптическую плотность и находят концентрацию хлорида натрия по калибровочной кривой.

Содержание хлорида натрия в поте составляет 56 мМ/л, определенное титрованием нитратом серебра 53 мМ/л.

Пример 3. В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 1 мг измельченного сульфокатионита марки КУ-2-8 в кислотной форме зарядки, представляющего собой сульфированный сополимер стирола и дивинилбензола с содержанием сульфогрупп 6,3 мМ/г, добавляют 1 каплю 0,1% раствора метилового красного в 60% этаноле и 20 мкл пота больного муковисцидозом. Смесь перемешивают, через 2 минуты спектрофотометрически определяют оптическую плотность и находят концентрацию хлорида натрия по калибровочной кривой.

Содержание хлорида натрия в поте составляет 76,8 мМ/л, определенное титрованием нитратом серебра 73,1 мМ/л.

Пример 4. В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 1,5 мг измельченного сурьмянофосфорнокремневого катионита марки СФ-кк с содержанием фосфоновокислотных групп 2,5 мМ/г, добавляют 1 каплю 0,1% раствора метилового красного в 60% этаноле и 20 мкл пота больного муковисцидозом. Смесь перемешивают, через 2 минуты спектрофотометрически определяют оптическую плотность и находят концентрацию хлорида натрия по калибровочной кривой.

Содержание хлорида натрия в поте составляет 46,9 мМ/л, определенное титрованием нитратом серебра 44,7 мМ/л.

Список литературы.

1. Капранов Н.И., Рочинский С.В. Муковисцидоз. М., Изд-во РАМН, 1995 г.

2. Shwachman Н., Mahmoodian A. Bibl.Paediatr.,1967,v.86, p. 158.

3. Gibson L.E., Cooke R. E. Pediatrics., 1959, v.23, p.545.

4. Пат. США N 3449080, МКИ G 01 N 31/40, 33/16, заявл.29.10.64 г., опубл. 10.06.69 г.

Использование: в медицине, а именно при диагностике муковисцидоза для определения степени нарушения функционирования хлоридного канала клеточных мембран по изменению концентрации хлорида натрия в поте пациента. Пробу пота пациента обрабатывают сильнокислотными катеонитами в кислотной форме в присутствии кислотно-основного индикатора. Предварительно сильнокислотные катеониты в кислотной форме отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Определение концентрации хлорида натрия проводят спектрофотометрически, а муковисцидоз диагностируют по возрастанию концентрации хлорида натрия в поте пациента. Способ позволяет более точно и быстро определить содержание хлорида натрия в поте по концентрации катионов натрия, а также уменьшить продолжительность проведения анализа по сравнению с прототипом в 5-7 раз.

Способ определения содержания хлорида натрия в поте больного муковисцидозом, включающий обработку пота пациента катионитами в кислотной форме в присутствии кислотно-основного индикатора с последующей диагностикой муковисцидоза по возрастанию концентрации хлорида натрия, отличающийся тем, что обработку пробы пота проводят сильнокислотными катионитами, которые предварительно отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, а определение концентрации хлорида натрия проводят спектрофотометрически.