СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ НА СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНЫ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и экспериментальной биологии, в частности к онкологии и иммунологии, касается оценки клеточно-опосредованного иммунитета (гиперчувствительности замедленного типа) у человека и животных в состоянии сенсибилизации и при иммунодефицитных состояниях.

Известен способ определения миграционной активности лейкоцитов с использованием агаровых блоков, заключающийся в приготовлении блоков с содержанием сыворотки 0,8-1,2% и внесении в лунки агара лейкоцитов, предварительно проинкубированных с исследуемым антигеном. Способ предусматривает оценку результатов реакции через 17 часов от начала ее, однократно, используемая доза лейкоцитов на лунку - 1,5-1,7•10⁶. Индекс миграции рассчитывают как процентное отношение ширины зон миграции лейкоцитов под влиянием антигена к ширине зон в контроле без антигена [1].

Данный способ обеспечивает повышение точности измерения зон миграции лейкоцитов и расчета индекса миграции за счет достижения более высокой четкости границ зон при использовании концентрации сыворотки в агаре в 10 раз меньше, чем применялось ранее, позволяет снизить ошибку измерения зон лейкоцитов до 4-5%. Однако этот способ все же оказывается недостаточно точным для качественной оценки и количественного определения максимальной величины диагностического эффекта угнетения миграции лейкоцитов. Высокая доза лейкоцитов на лунку требует взятия 10-15 мл венозной крови, что существенно ограничивает возможность применения способа с целью обследования детей в возрасте до 3-4 лет, когда удается однократно взять не более 3-5 мл крови. Кроме того, использование высокой дозы лейкоцитов, предусмотренное данным способом, делает недостаточными 10-15 мл венозной крови для проведения обследования указанным способом у больных с ярко выраженной лейкопенией после химиотерапии при лечении опухолей. Взятие дополнительных количеств крови повышает травматичность способа.

Известен способ оценки миграционной активности лейкоцитов периферической крови по отношению к специфическому тканевому антигену при опухолевых заболеваниях с использованием агаровых блоков с 0,8 - 1,2% содержанием сыворотки, заключающийся в выделении лейкоцитов из плазмы крови пациентов, внесении проб суспензии клеток в лунки агаровых блоков в дозе 2,5 - 5 • 10⁵ клеток и инкубации их с антигеном при 37^oC с 5% содержанием CO₂ в инкубационной камере в 3 - 4 одинаковых чашках (блоках) одновременно (параллельно), фиксации реакции в них поочередно в интервале 16 - 22 часа от начала инкубации 10% раствором формальдегида через равные промежутки времени (2-3 часа), подсушивании, удалении агара, измерении зон миграции с помощью бинокуляра, имеющего микрометрическую шкалу. Определяют среднюю ширину зон миграции лейкоцитов в контрольных лунках без антигена I_к и среднюю ширину зон миграции в лунках с антигеном I_а как расстояние от границы лунки до границы зоны миграции. Для расчета индекса миграции (ИМ) используют формулу
ИМ = I_а/I_к•100%.

Вычисляют ИМ при различных значениях времени инкубации, т.е. оценивают реакцию лейкоцитов в агаре при 3 - 4 значениях времени. Выявляют максимальное значение эффекта угнетения миграции, соответствующее наименьшему значению индекса миграции (Максимальный эффект угнетения миграции в % = 100% - ИМ миним.).

Данный способ, выбранный как прототип, обеспечивает повышение точности определения эффекта угнетения миграции лейкоцитов в ответ на специфический антиген в среднем на 10% по сравнению с известными аналогами за счет оценки ИМ в динамике и в 3 - 8 раз снижение количества крови, необходимой для оценки за счет снижения дозы клеток на лунку [2].

Однако этот способ является недостаточно точным для количественного определения ответа на антиген и недостаточно достоверным в оценке эффекта угнетения, так как оценка размеров зон миграции зависит от субъективной ошибки экспериментатора или лаборанта при измерении ширины кольца зоны миграции с помощью микрометрической шкалы бинокуляра. Ошибка измерения возрастает со снижением четкости границ зоны миграции и границ лунки, может достигать при этом 5 - 10%, что снижает диагностическую ценность метода. Для осуществления метода требуется дорогостоящий агар, а для оценки ответа на антиген в динамике с использованием 3 - 4 агаровых блоков параллельно расход агара и крови увеличивается в 3 - 4 раза, возрастает трудоемкость метода при постановке и оценке результатов в 3 - 4 раза. Недостатком способа также является использование для фиксации реакции вредного вещества - формалина.

Целью изобретения является повышение диагностической информативности, упрощение и ускорение способа, существенное снижение расхода крови, исключение дорогостоящих и вредных реактивов. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа берут пробы инкубационной среды по 10 - 20 мкл из одной пробирки через 2 - 3 часа в диапазоне 16 - 22 часа от начала инкубации и определяют содержание глюкозы непосредственно в инкубационной среде, оценивают расход глюкозы в пробах с антигеном и без антигена (контрольных) по сравнению с инкубационной средой без клеток и вычисляют индекс расхода глюкозы ИРГ в % в ответ на антиген при разном времени инкубации клеток от начала реакции по формуле
ИРГ = расход глюкозы (с антигеном)/расход глюкозы (без антигена)•100%,
и при значениях ИРГ меньше 95% отмечают эффект угнетения расхода глюкозы.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Приготовление суспензии лейкоцитов.

Исследование проводят на свежей крови больного, которую собирают из вены в объеме 3 - 5 мл в пробирку с консервантом - 2,7%-ным раствором трилона Б, pH 7,3, из расчета по 0,5 мл на 5 мл крови. Пробирки с кровью выдерживают при комнатной температуре 30 - 40 мин. Этого времени достаточно для оседания эритроцитов, плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают и центрифугируют при 1200 об/мин 5 мин. Осадок, содержащий лейкоциты, дважды отмывают раствором Хенкса, не содержащим ионов кальция и магния, при тех же условиях. Осадок лейкоцитов после заключительного отмывания ресуспендируют в растворе Хенкса, подсчитывают концентрацию лейкоцитов и доводят ее до 2,5 - 5 • 10⁷ клеток в 1 мл.

2. Постановка реакции миграции лейкоцитов.

Берут 7 пластиковых пробирок объемом 4 - 5 мл, диаметром в сечении 1 см - 3 для контроля без антигена, 3 - для испытания с антигеном и 1 - контроль без клеток и без антигена на стартовую концентрацию глюкозы в инкубационной среде. Из исходной суспензии лейкоцитов вносят по 10 мкл в 3 контрольные пробирки, т. е. по 2,5 - 5 • 10⁵ клеток, в них оценивают спонтанный или фоновый расход глюкозы без влияния антигена. В другие три пробирки также вносят по 10 мкл суспензии клеток, а затем по 10 мкл раствора антигена в концентрации, обладающей специфической активностью. В первые три пробирки вместо раствора антигена вносят по 10 мкл раствора, используемого для растворения антигена, но не содержащего антиген (0,9% хлористый натрий, раствор Хенкса или среду 199). В последнюю седьмую пробирку вносят 10 мкл раствора Хенкса, не содержащего лейкоциты, и 10 мкл растворителя для антигена, не содержащего антиген. Во все пробирки вносят по 250 - 500 мкл инкубационной среды 199, содержащей 1% сыворотки IV-й группы крови человека или эмбриональной сыворотки теленка, а также антибиотик мономицин из расчета 200 ЕД на 1 мл среды (или пенициллин + стрептомицин по 5,4 мг и 9,0 мг соответственно на 100 мл среды). Используют соотношение дозы клеток и объема инкубационной среды: на 5 • 10⁵ лейкоцитов - 500 мкл среды, т.е. на 10⁵ - 100 мкл среды. Это оптимальное соотношение, подобранное опытным путем. В пробирках, содержащих антиген, оценивают расход глюкозы лейкоцитами в результате их ответа на антиген. Пробирки накрывают крышками неплотно и помещают в эксикатор с влажной атмосферой, содержащей 5% CO₂. Эксикатор помещают в термостат при 37^oC. Инкубацию проводят 16 - 22 часа. Через 16 часов инкубации отбирают пробы инкубационной среды из всех пробирок по 20 мкл и оставляют эксикатор с пробирками в термостате для дальнейшей инкубации. Следующие пробы берут через каждые два часа (18, 20 и 22 часа инкубации) или через 3 часа (на 19, 21 час).

Оценка результатов реакции.

Концентрацию глюкозы в пробах определяют по методу с использованием антронового реактива [3]. К каждой пробе, помещенной в стеклянную пробирку (20 мкл) добавляют 380 мкл дистиллированной воды, т.е. разводят в 20 раз. Пробирки помещают в ледяную баню и вносят по 0,8 мл свежеприготовленного антронового реактива (0,2 г антрона, растворенного в 100 мл 95% серной кислоты). Пробы тщательно перемешивают, затем нагревают 10 мин в кипящей водяной бане и сразу охлаждают в ледяной бане. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 620 нм. Предварительно строят калибровочную кривую: зависимость оптической плотности от концентрации глюкозы в пробе. Определяют исходную концентрацию глюкозы в каждой пробе с учетом разведения в 20 раз, вычисляют среднюю концентрацию глюкозы в стартовой пробирке без клеток, в контрольных пробирках без антигена и в опытных - с антигеном. Вычисляют расход глюкозы без антигена как разницу концентраций глюкозы стартовой и - в контроле (/C/глюк.старт.-/C/глюк.К) и расход глюкозы в опыте с антигеном (/C/глюк. старт.-/C/глюк.Оп). Реакцию на антиген определяют путем расчета индекса расхода глюкозы ИРГ по формуле
ИРГ = расход глюкозы (опыт)/расход глюкозы (контроль)•100%.

Оценивают реакцию лейкоцитов в динамике, т.е. зависимость величины индекса расхода глюкозы от времени инкубации клеток при 3-4 значениях времени в оптимальном интервале 16-22 часа от начала инкубации. Выявляют максимальное значение эффекта угнетения расхода глюкозы, соответствующее минимальному значению индекса расхода глюкозы ИРГ (фиг. 1, кривая "A").

Пример 1. Венозную кровь от больной с диагнозом рак яичника (аденокарцинома) в объеме 5 мл с консервантом - 2,7% раствором трилона Б, 0,5 мл выдержали при комнатной температуре 40 минут. После оседания эритроцитов плазму, обогащенную лейкоцитами, отобрали и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин. Осадок, содержащий лейкоциты, дважды отмывали раствором Хенкса без кальция и магния. После второй отмывки осадок лейкоцитов ресуспендировали в полном растворе Хенкса, подсчитали общее количество выделенных лейкоцитов, довели концентрацию до 5 • 10⁷ в 1 мл. Конечный объем суспензии рассчитывали по формуле
Объем = общее количество клеток/5,0•10⁷.

Взяли семь пластиковых пробирок объемом 4 мл, диаметром 1 см: 3 - для контроля, 3 - для проб с антигеном и 1 - для инкубационной среды без клеток. В 3 контрольные пробирки внесли по 10 мкл исходной суспензии лейкоцитов (5 • 10⁵ клеток) и по 10 мкл раствора Хенкса. В 3 опытные пробирки внесли по 10 мкл суспензии клеток и по 10 мкл раствора антигена, выделенного из ткани аденокарциномы яичника, в концентрации 200 мкг в 1 мл раствора Хенкса. В седьмую пробирку внесли 20 мкл раствора Хенкса. Во все пробирки добавили по 0,5 мл инкубационной среды 199, содержащей 1% сыворотки IV-й группы крови человека и мономицин - 200 ЕД в 1 мл. Пробирки неплотно накрыли крышками и поместили в эксикатор с влажной атмосферой, содержащей 5% CO₂.

Эксикатор поместили в термостат при 37^oC. Через 16 часов инкубации из каждой пробирки взяли по 20 мкл пробы инкубационной среды и перенесли в стеклянные пробирки объемом 10 мл. Продолжили инкубацию лейкоцитов в термостате в тех же условиях. Серию проб N 2 взяли через 2 часа, т.е. на 18 часов инкубации. Серию проб N 3 - на 20 часов, N 4 - при 22-часовой инкубации. К каждой пробе - 20 мкл - добавили 380 мкл дистиллированной воды, пробы таким образом развели в 20 раз, конечный объем проб - 0,4 мл. Пробирки поместили в ледяную баню. Приготовили свежий антроновый реактив: 14 мг антрона растворили в 7 мл 95% кислоты, из расчета 1 мл кислоты + 2 мг антрона. В пробирки внесли по 0,8 мл антронового реактива. Содержимое пробирок тщательно перемешали путем встряхивания, поместили в кипящую водяную баню на 10 минут, затем перенесли пробирки в ледяную баню. Измерили оптическую плотность содержимого пробирок на спектрофотометре при длине волны 620 нм. По калибровочной кривой определили концентрацию глюкозы в каждой пробирке, с учетом разведения в 20 раз вычислили среднюю концентрацию глюкозы в стартовой пробирке без клеток, в контроле без антигена как среднюю из трех пробирок при каждом отдельном значении времени от начала инкубации (16, 18, 20 и 22 часа) и в опытных пробирках с антигеном. Вычислили разницу между стартовым значением концентрации глюкозы и значением концентрации глюкозы в контроле без антигена - спонтанный расход глюкозы лейкоцитами, а также расход глюкозы в опыте с антигеном: РГ(К)=/C/глюк.старт.-/C/глюк."К", РГ(О)= /C/глюк. старт.-/C/глюк.опыт. Реакцию лейкоцитов на антиген определили путем расчета индекса расхода глюкозы ИРГ по формуле
ИРГ = РГ опыт/РГ контроль • 100%.

Получили значение ИРГ, равные 92, 90, 88, 85% соответственно для 16, 18, 20 и 22 часов инкубации. При значениях ИРГ ниже 95% отмечают эффект угнетения расхода глюкозы лейкоцитами под влиянием антигена, т.е. при 16, 18, 20 и 22 час, максимальный эффект угнетения соответствует 22 час.

Пример 2. Кровь берут у той же больной, все процедуры, связанные с получением суспензии лейкоцитов в той же концентрации, выполняют как в примере 1, за исключением того, что реакцию лейкоцитов на специфический антиген в той же концентрации испытывают по прототипу, т.е. способом оценки миграционной активности лейкоцитов периферической крови по отношению к специфическому антигену при опухолевых заболеваниях. Предварительно готовят агаровые блоки, реакцию фиксируют при тех же значениях времени от начала инкубации и вычисляют индекс миграции. Получили значения индекса миграции (ИМ), равные 97, 96, 96 и 97%, соответственно 16, 18, 20 и 22 часам инкубации.

Пример 3. Кровь берут у больной с неопухолевой патологией, все процедуры выполняют, как в примере 1, с тем же специфическим антигеном, пробы инкубационной среды берут при тех же значениях времени инкубации. Получили значения индекса расхода глюкозы (ИРГ) 104, 105, 105 и 103% соответственно 16, 18, 20 и 22 часам.

Пример 4. Все процедуры выполняют, как в примере 2, за исключением того, что кровь у больной с неопухолевой патологией, а именно, у больной из примера 3. Получили значения индекса миграции, равные 103, 104, 104 и 103%, соответственно 16, 18, 20 и 22 часам.

На фигуре 1 показана динамика средних значений ИРГ в зависимости от времени реакции в группе больных раком яичника (аденокарцинома), 10 больных и в контрольной группе (с неопухолевой патологией), 10 больных, при обследовании их предлагаемым способом с использованием антигенного препарата из ткани аденокарциномы яичника. Кривая "а" - больные раком, "б" - контрольная группа.

На фигуре 2 показана динамика реакции лейкоцитов человека на специфический антиген, оцененная по прототипу, т.е. зависимость средних значений индекса миграции (ИМ) лейкоцитов от времени инкубации с антигеном. Кривая "а" - больные раком яичника (аденоукарцинома), кривая "б" - контрольная группа больных с неопухолевой патологией.

На фигуре 3 показана динамика реакции лейкоцитов больных раком яичника на специфический антиген, полученная заявляемым способом (зависимость значений ИРГ от времени инкубации) - "а", и по прототипу (зависимость значений ИМ от времени инкубации) - "б".

Как видно из приведенных примеров и статистических данных, показанных на фигурах 1, 2, 3, реакция лейкоцитов периферической крови больных раком яичника на специфический антиген, проявляющаяся в виде эффекта угнетения, более выражена при оценке ее заявляемым способом - путем определения индекса расхода глюкозы (ИРГ), по сравнению с прототипом - путем определения индекса миграции (ИМ). Средние значения ИРГ, соответствующие максимальному эффекту угнетения в диапазоне времени 18-24 часа, - 83±5,5%, средние значения ИМ в том же интервале времени - 93±2%. Усиление эффекта угнетения, определяемое по ИРГ заявляемым способом, достоверно по сравнению со значениями ИМ, определяемыми по прототипу, P меньше 0,01 по непараметрическому критерию Уилкоксона-Манна-Уитни. Различий между ИРГ и ИМ, выраженных в процентах, в контрольной группе больных не выявлено, P больше 0,05.

Различия средних значений ИРГ (фиг. 1) в оптимальном диапазоне значений времени инкубации у больных раком яичника (кривая "а") и у контрольных больных существенны с высоким уровнем достоверности - P меньше 0,01. Различия средних значений ИМ у больных выявлены на пределе достоверности, P = 0,05.

Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с известными повышение диагностической информативности оценки реакции лейкоцитов на специфические антигены, а именно, эффекта угнетения активности лейкоцитов в среднем на 10-12%, упрощение и ускорение способа, снижение в 3-4 раза расхода крови, исключение дорогостоящих и вредных реактивов.

Предлагаемым способом можно оценивать реакцию лейкоцитов человека и животных на любые тканевые и микробные антигены.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в иммунологии. Оценивают реакцию путем определения ее в динамике в интервале 16-22 ч от начала инкубации лейкоцитов с антигеном пластиковых пробирках с питательной средой, отбирая пробы инкубационной среды из одной пробирки через 2-3 ч, оценивая расход глюкозы (РГ) и вычисляя индекс расхода глюкозы (ИРГ) в ответ на антиген при разном времени инкубации клеток от начала реакции. Оценку осуществляют определением РГ в пробах с антигеном и без антигена по отношению к пробе инкубационной среды без клеток и расчета ИРГ как процентного отношения РГ под влиянием антигена к РГ в контроле без антигена. Способ обеспечивает ускорение, упрощение реализации и повышение диагностической информативности. 3 ил.

Способ оценки реакции лейкоцитов на специфические антигены, включающий инкубацию клеток с антигеном в присутствии сыворотки крови в среде инкубации и оценку ответа клеток на антиген по значению эффекта угнетения, отличающийся тем, что клетки и антиген вносят непосредственно в пластиковые пробирки с питательной средой, а оценку осуществляют по максимальному значению эффекта угнетения расхода глюкозы путем последовательного отбора 3 - 4 значений проб инкубационной среды, получаемых в период 16 - 22 ч от начала инкубации, определению расхода глюкозы в пробах с антигеном и без антигена по отношению к пробе инкубационной среды без клеток и расчету индекса расхода глюкозы по формуле Индекс расхода глюкозы = Расход глюкозы (с антигеном)/расход глюкозы (без антигена)• 100%.