СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ У ДЕТЕЙ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/86 G01N33/50 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, для диагностики состояний с повышенной тромбогенной опасностью и может быть использовано для выявления скрытого нарушения тромбоцитарного звена гемостаза на микроциркуляторном уровне у детей, больных муковисцидозом.

По данным генетических исследований, распространенность муковисцидоза (MB) в России составляет более 1:10000 новорожденных. Учитывая особенности и характер течения муковисцидоза у детей и большую вероятность развития различных осложнений, актуальной задачей является исследование тромбоцитарного звена гемостаза. Особое внимание необходимо уделять соотношению воспалительных изменений в очаге воспаления (in loko morbi) и системного воспаления при хронической бронхообструктивной патологии, так как воспалительная реакция с повышенной активностью провоспалительных факторов в бронхолегочной системе может переходить на уровень системного кровотока. Данные патологические изменения характеризуются субклинической хронической воспалительной реакцией с низкой активностью, что проявляется нарушениями в микроциркуляторном русле.

Известен способ исследования внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro. Сущность способа заключается в том, что производят забор крови, стабилизацию ее, разделение на плазму и эритроциты с получением богатой тромбоцитами плазмы, дезагрегацию тромбоцитов, анализ полученных данных, по которым судят о степени агрегации, стабилизацию крови после забора осуществляют цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, разделение крови с получением богатой тромбоцитами плазмы проводят центрифугированием, до введения дезагреганта из части богатой тромбоцитами плазмы получают обедненную, для пробы каждого пациента определяют экстремальные значения светопропускания, по обедненной тромбоцитами плазме - 100% светопропускания, по богатой тромбоцитами плазме - 0%, после введения дезагрегации снимают кривую дезагрегации, на которой фиксируют величину максимального значения радиуса дезагрегации, по которой судят о степени внутрисосудистой агрегации тромбоцитов (Патент РФ №2102754).

Известен способ оценки влияния агрегации тромбоцитов на факторы системы гемостаза при выполнении клинико-функциональных исследований, включающий исследование плазмы крови, при этом богатую тромбоцитами плазму делят на две аликвоты - первую и вторую и только в первой аликвоте выполняют необратимую агрегацию тромбоцитов под действием индуктора, измененную первую аликвоту и первоначальную вторую синхронно центрифугируют, получают в первом и втором случае бедную тромбоцитами плазму, раздельно определяют в первой и второй аликвотах содержащиеся в бедной тромбоцитами плазме идентичные факторы, вычисляют разницу между ними и по потреблению и высвобождению этих факторов оценивают степень агрегации тромбоцитов на факторы системы гемостаза (Патент РФ №2179318).

Известен способ исследования агрегации тромбоцитов, заключающийся в том, что обогащенную тромбоцитами плазму помещают в камеру реоскопа, перемешивают и измеряют интегральную оптическую плотность всех агрегатов, интегральную оптическую плотность всех агрегатов, образовавшихся в результате взаимодействия клеток, интегральную оптическую плотность каждого агрегата по окончании процесса агрегации и рассчитывают индекс R агрегатообразования по формуле: R=K/N×100%, где K - количество крупных агрегатов с интегральной оптической плотностью больше 151 усл. ед.; M - общее количество агрегатов с интегральной оптической плотностью больше 10 усл. ед.; 100% - коэффициент, определяющий процентное выражение отношения K/N (Патент РФ №2421724).

Известен способ выявления нарушений агрегации тромбоцитов, для осуществления которого берут кровь, выделяют богатую тромбоцитами плазму и наносят на предметное стекло, где проводят тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока при использовании минимальных взаимопотенциирующих концентраций индукторов с обязательным включением в комбинации коллагена и вычислением среднего значения индукции агрегации коллагеном, по величине которого судят о тонких нарушениях агрегационной способности тромбоцитов. (Патент РФ №2393485). Способ выбран нами в качестве прототипа.

Недостатком способа является использование плазмы крови, получаемой путем центрифугирования, выделение плазмы, расчет коэффициентов индукции агрегации.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики нарушений агрегации тромбоцитов для выявления нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при муковисцидозе у детей.

Техническим результатом осуществления способа является то, что диагностика нарушений агрегации тромбоцитов позволяет вовремя заметить возможные нарушения в микроциркуляторном русле при муковисцидозе и провести терапевтическую коррекцию этих нарушений.

Сущность способа заключается в том, что проводят тесты на агрегацию тромбоцитов с индукторами в цельной крови у детей, больных муковисцидозом, а в качестве индукторов агрегации используют: растворимый рецептор тромбина-пептид-6 (TRAP-6), раствор аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) или арахидоновую кислоту.

Способ осуществляют следующим образом.

Агрегацию тромбоцитов определяют в цельной крови на агрегометре «Multiplate» (VD, Германия). Кровь необходимо использовать в течение 30 минут с момента забора. Не требуется предварительное центрифугирование и выделение богатой тромбоцитами плазмы. В кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl(3 мМоль/л) при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином. Инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: пептид -6 (TRAP-6), аденозиндифосфат (АДФ) или арахидоновая кислота. В каждую кювету добавляют один индуктор и инкубируют 6 минут. Скорость агрегации тромбоцитов оценивают на экране прибора по кривой агрегации и площади под кривой (U), которая рассчитывается агрегометром автоматически (Рис.1). Измерение агрегации тромбоцитов проводят импедансным способом. Импедансный (англ. impedance, от лат. impedio - препятствую) - метод исследования двойного электрического слоя, механизма и кинетики процессов на границе электрод - электролит, который основан на измерении полного сопротивления - импеданса электрохимической ячейки и зависимости этого сопротивления от частоты переменного тока. Ячейка включает исследуемый и вспомогательный электроды, между которыми находится электролит.

Прибор рисует кривую агрегации на графике, по оси Y скорость образования агрегатов, а по оси X время. По значению площади под кривой U судят о состоянии агрегационной функции тромбоцитов. Для каждого активатора: пептид -6(TRAP-6), арахидоновая кислота, и аденозиндифосфат (АДФ) строятся отдельные графики.

Затем проводят оценку площади под кривой U в сравнении с референсными интервалами для различных возрастных групп, определенными у здоровых детей:

0,1-12 мес.: с (TRAP-6) 32-78 U; с АДФ 24-83 U; с арахидоновой кислотой 27-73 U;

1,1-4 года: с (TRAP-6) 43-90 U; с АДФ 32-75 U; с арахидоновой кислотой 45-90 U;

5-9 лет: с (TRAP-6) 58-95 U; с АДФ 35-74 U; с арахидоновой кислотой 56-90 U;

10-18 лет: с (TRAP-6) 54-97 U; с АДФ 28-74 U; с арахидоновой кислотой 52-88 U.

Значение U выше максимального референсного значения, соответствующего возрастной группе, свидетельствует о гиперагрегации тромбоцитов с данным индуктором агрегации.

Значение U ниже порогового уровня, соответствующего возрастной группе, свидетельствует о гипоагрегации тромбоцитов с данным индуктором.

На основании полученных данных можно говорить о том, что изменения, происходящие в организме больного муковисцидозом ребенка, влияют и на агрегационные способности тромбоцитов. В случае выявления нарушения агрегации проводят коррекцию дисфункции тромбоцитарного звена гемостаза назначением, в дополнение к базисной терапии, препаратов, обладающих ангиопротективным действием: ангигин, эндотелон, ангиовит, аргинин и антиагрегантными свойствами: пентоксифилин, кардиомагнил, плавике.

Данные лабораторные тесты могут использоваться в диагностике нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при муковисцидозе у детей. Нами обследовано 50 больных с муковисцидозом с легочно-кишечной формой в возрасте от 3 месяцев и до 15 лет. Контрольную группу составили 40 здоровых детей того же возраста. Диагноз муковисцидоза был поставлен на основании положительных потовых тестов (>60 ммоль/л концентраций натрия и хлора в потовой жидкости) и подтвержден генетическими исследованиями.

Изобретение соответствует критерию «новизна», т.к. в настоящее время не существует способа для выявления изменений в агрегационных свойствах тромбоцитов при муковисцидозе, а следовательно, предупреждения нарушений микроциркуляции, ишемических изменений в очаге воспаления.

Нами показано, что рутинные методы, а именно определение стандартных показателей общего анализа крови, коагулограммы, зачастую не дает нам полноценной картины о процессах, происходящих на микроциркуляторном уровне.

Клинический пример 1.

Девочка, Ж.Е., 3 лет находилась в отделение пульмонологии и аллергологии с диагнозом: Кистофиброз поджелудочной железы (муковисцидоз Е 84.0), генотип 218ins A/ 2143 delT, легочно-кишечная форма, тяжелое течение. Хронический диффузный бронхит. ДН 1 степени. Жалобы: на влажный кашель продуктивный кашель с умеренным количеством (в среднем 50 мл) желто-серой мокроты, плохую прибавку в весе. Больна с 2-х месяцев, когда появился сухой приступообразный кашель с вязкой мокротой и комочками густой зеленой слизи. При обследовании по месту жительства заподозрен диагноз «муковисцидоз», который был подтвержден лабораторными тестами (хлориды пота 147 ммоль/л). Дальнейшее обследование проводили в НЦЗД РАМН отделении пульмонологии и аллергологии. Диагноз подтвержден генетическими исследованиями. При осмотре обращает на себя внимание низкое физическое развитие ребенка. Вес 11,8 кг; рост 92,5 см. При лабораторном обследовании получены следующие показатели крови: эритроциты 4,82x10¹²/л, гемоглобин 127 г/л, лейкоциты 6,12xl0%; СОЭ 7 мм/час, тромбоциты 448x10⁹/л. В коагулограмме нарушений не выявлено. Проведены тесты для оценки агрегационной функции тромбоцитов. Выявлены следующие значения: с пептидом TRAP-6 - 27 U (референсные значения 43-90 U); с АДФ - 17 U (референсные значения 32-75 U); с арахидоновой кислотой 12 U (референсные значения 45-90 U), что свидетельствует о гипоагрегации тромбоцитов. Данные изменения характеризуют нарушение агрегации тромбоцитов на уровне микроциркуляции при нормальном количестве тромбоцитов в периферической крови. На основании полученных данных к базисной терапии был добавлен викасол, препараты кальция и магния. Через 14 дней проведено повторное исследование агрегации тромбоцитов. Получены данные агрегации: с TRAP-6 - 84 U; с АДФ - 27 U; с арахидоновой кислотой - 61 U (уровень значимости составил p<0,05). На фоне проводимой терапии отмечали положительную динамику со стороны бронхо-легочной системы, возможно, и за счет коррекции нарушений агрегации тромбоцитов на уровне микроциркуляции.

Клинический пример 2.

Девочка А., 7 лет находилась в отделении пульмонологии и аллергологии с диагнозом:

муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение. Хронический диффузный бронхит.Распространенные цилиндрические бронхоэктазы обоих легких. Гипотрофия 1-11 степени. Формирование легочного сердца. Легочная гипертензия. Вторичная ангиопатия сетчатки. Жалобы на частый приступообразный кашель, затрудненное дыхание, одышку, периодические головные боли. С рождения отмечалась плохая прибавка массы тела, частые пневмонии. Диагноз установлен в 3 месяца, подтвержден генетически - гетерозигота по del F508. Периодически возникают кровохарканья. При осмотре грудная клетка вздута, дыхание ослаблено с обеих сторон, рассеянные сухие двусторонние хрипы. ЧСС 118 в мин. ЧДД 22 в мин. В анализе крови выявлено:

эритроциты 4,95xl0¹²/л, гемоглобин 130 г/л. лейкоциты 20,7xl0⁹/л, тромбоциты 564x10% СОЭ 6 мм /час. Агрегация тромбоцитов: с TRAP-6 - 125 U (референсные значения 58-95 U),c АДФ-78 U (референсные значения 35-74 U), а с арахидоновой кислотой - 101 U (референсные значения 56-90 U), что свидетельствует о гиперагрегации тромбоцитов. На основании этих показателей к базисной терапии добавлена метаболическая терапия, назначены: карнитин, витамины E, B и трентал, обладающий антиагрегатным и ангиопротекторным действием. Через 14 дней агрегация тромбоцитов в динамике составляла: с TRAP-6 - 95 U, а с АДФ - 59 U.

Таким образом, отмечали положительную динамику в агрегационных свойствах тромбоцитов, что привело к нормализации показателей. Нарушение микроциркуляции в сосудах различных органов связано с образованием микротромбов в токе крови и оседанием этих сгустков в мелких кровеносных сосудах. У данного ребенка имелась ангиопатия сетчатки, что также может служить проявлением нарушения метаболизма в тромбоцитах и реологии на уровне микроциркуляторного русла. В результате недостаточного поступления кислорода страдает функция органов мишеней (легких, бронхов, пищеварительной системы) с образованием микротромбов в токе крови и оседанием этих сгустков в мелких кровеносных сосудах.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов способствует своевременной диагностике нарушении агрегационных свойств тромбоцитов и коррекции их путем назначения необходимых препаратов в дополнение к базисной терапии, что позволяет устранить дисфункцию эндотелия и агрегации тромбоцитов на уровне микроциркуляции и помогает пациентам в условиях тканевой гипоксии.

Преимущества предлагаемого способа диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза у детей заключается в использовании цельной крови, индукторы добавляют в стандартных дозах, используют импедансный способ проведения измерений, результаты которого представлены в виде площади под кривой (U), а не в секундах, что дает дополнительную оценку способности тромбоцитов к агрегации.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей, включающий проведение теста на агрегацию тромбоцитов с индукторами на агрегометре «Multiplate», при этом в кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином, инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат, арахидоновая кислота, при этом скорость агрегации тромбоцитов изображается на экране прибора в виде кривой и автоматически рассчитывается площадь под кривой U, по значению площади U под кривой судят о состоянии агрегации трмбоцитов в сравнении с референсными значениями в группе здоровых детей и при повышении порогового значения площади U выше референсного судят о гиперагрегации тромбоцитов, а при понижении порогового значения площади U ниже референсного судят о гипоагрегации тромбоцитов. Изобретение обеспечивает своевременную диагностику нарушений в микроциркуляторном русле при муковисцидозе. 2 пр., 1 ил.

Способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей, включающий проведение теста на агрегацию тромбоцитов с индукторами, отличающийся тем, что агрегацию тромбоцитов определяют в цельной крови на агрегометре «Multiplate», при этом в кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином, инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат, арахидоновая кислота, при этом скорость агрегации тромбоцитов изображается на экране прибора в виде кривой и автоматически рассчитывается площадь под кривой U, по значению площади U под кривой судят о состоянии агрегации трмбоцитов в сравнении с референсными значениями в группе здоровых детей и при повышении порогового значения площади U выше референсного судят о гиперагрегации тромбоцитов, а при понижении порогового значения площади U ниже референсного судят о гипоагрегации тромбоцитов.