СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, и может быть использовано для выявления лиц с повышенным риском возникновения локального послеоперационного геморрагического диатеза.

Известен способ определения функционального состояния тромбоцитов по их способности образовывать агрегаты под действием различных индукторов агрегации (АДФ - аденозиндифосфорная кислота, адреналин, серотонин, ристомицин, фактор агрегации тромбоцитов и т.д.). Повышенная агрегационная активность тромбоцитов может быть одной из причин развития микротромбозов и тромбозов в сосудистом русле. Сниженная агрегационная активность тромбоцитов указывает на повышенную опасность возникновения геморрагических осложнений [Балуда В. П. , Баркаган 3. С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза.- Томск, 1980.- 314 с.].

Недостатком традиционных способов определения агрегационной активности тромбоцитов является то, что для получения объективной и полной информации необходимо проводить исследование с использованием набора индукторов агрегации, что является целесообразным при обследовании больных с врожденными тромбоцитопатиями, у которых повышенная кровоточивость может быть связана с нарушением агрегации на один из индукторов. Такое дорогостоящее обследование ограничивает его применение только специализированными гематологическими лабораториями. Следует также отметить, что способ не позволяет выявить скрытую приобретенную недостаточность агрегационной функции тромбоцитов, являющуюся одной из причин возникновения местной повышенной кровоточивости после оперативного вмешательства. Способ не учитывает и участия сосудистой стенки в механизмах сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Известен также способ определения функционального состояния стенки сосудов путем исследования крови до и после их пережатия манжетой сфигмоманометра на плече, когда с целью повышения специфичности способа в капиллярной крови, взятой из пальца, определяют величину АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, вычисляют отношение величин АДФ-индуцированной агрегации до и после пережатия сосудов конечности и определяют функциональное состояние стенки сосудов по вычисленному соотношению [Балуда В.П., Лакин К.М., Лукоянова Т. И. и др. Способ определения функционального состояния стенки сосудов: а.с.СССР N 1084010 // БИ.- 1984.- N 13.- C.17].

Недостаток способа заключается в том, что гипоксия создается в венозном русле, а исследование агрегационной способности тромбоцитов проводится в капиллярной крови. Кроме того, способ обеспечивает выявление только усиления проагрегантных свойств тромбоцитов и сосудистой стенки.

Известен также способ определения функционального состояния системы гемостаза, основанный на оценке атромбогенных свойств стенки сосудов при создании кратковременной (5 мин.) локальной ишемии, вызываемой накладыванием манжеты сфигмоманометра на плечо испытуемого и созданием в ней давления, превышающего систолическое давление на 10 мм рт.ст., что ведет к высвобождению из эндотелия сосудов здоровых людей в кровь простациклина, антитромбина III, активаторов плазминогена (манжеточная проба). Изменения антиагрегационной, антикоагулянтной и фибринолитической активности крови, взятой до и после кратковременной искусственной окклюзии сосудов, позволяют судить о состоянии атромбогенности сосудов [Балуда В.П., Соколов Е.И., Балуда М.В. и др. Манжеточная проба в диагностике функционального состояния сосудистого звена системы гемостаза // Гематология и трансфузиология.- 1987.-N 9.- С.51-53].

Недостатком данного способа является болезненность процедуры и невозможность его применения у больных с повышенным систолическим давлением из-за длительности гипоксического состояния, травматизации тканей, что в свою очередь искажает результаты исследования.

В. П. Балуда и др. [Балуда В. П., Тамаева Т. Г., Горбунова Н. А. и др. Роль антиагрегационных свойств стенки сосудов в нарушениях гемокоагуляции // Проблемы гематологии и переливания крови.- 1982.- N 12.-С. 37-39] функциональное состояние сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза определяют по степени торможения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после 3-х минутного изменения венозного оттока, вызванного наложением манжетки сфигмоманометра на предплечье.

Недостатком способа можно считать то, что при создании венозного застоя проводится исследование агрегации тромбоцитов капиллярной крови, которая по своим свойствам близка артериальной.

Наиболее близким аналогом предлагаемому способу является способ авторов Балуды В. П., Лукояновой Т. И., Балуды М.В. Метод определения антиагрегационной активности стенки сосудов человека // Лабораторное дело.- 1983.- N6.- С. 17-20]. Способ заключается в следующем. В шприц, содержащий 1 мл раствора лимоннокислого натрия, из кубитальной вены без наложения жгута берут 9 мл крови, смешивают с антикоагулянтом и до начала центрифугирования хранят в сосуде с тающим льдом. На вторую руку накладывают манжетку сфигмоманометра, определяют систолическое давление, повышают давление в манжетке на 10 мм рт. ст. и через 3 минуты берут 9 мл крови в шприц с антикоагулянтом. Кровь немедленно центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин, для получения богатой тромбоцитами плазмы. Плазму отсасывают, немедленно помещают в тающий лед и до начала исследований хранят в нем. Кровь повторно центрифугируют 20 минут при 3500 об/мин, для получения бедной тромбоцитами плазмы, которую отсасывают и хранят в тающем льде. Подсчитывают количество тромбоцитов в плазме, богатой тромбоцитами, полученной до создания венозного застоя. Плазму, богатую тромбоцитами, разводят плазмой, бедной тромбоцитами, полученной до (1-я проба) и после (2-я проба) венозного застоя до концентрации 200000 в 1 мкл. Полученную смесь встряхивают и инкубируют 10 минут при 20-22^oC. Определяют агрегацию тромбоцитов в обеих пробах по Born с индуктором агрегации АДФ в конечной концентрации 10^-6-10^-7 М и при температуре в агрегометре 20-22^oC. Затем определяют параметр, характеризующий агрегацию в этих пробах, по которому судят об антиагрегационной активности крови. Антиагрегационная активность стенки сосудов выражается индексом антиагрегационной активности тромбоцитов, который равен отношению величины степени агрегации тромбоцитов до ишемии на величину степени агрегации тромбоцитов после ишемии. Уменьшение индекса указывает на снижение антиагрегационной активности стенки сосудов.

Способ позволяет выделить лиц со сниженной антиагрегационной активностью стенки сосудов, у которых имеется склонность к тромбофилии.

Однако не дает возможность диагностировать скрытую функциональную недостаточность системы гемостаза, предрасполагающую к развитию геморрагического диатеза микроциркуляторного генеза.

Таким образом, все вышеперечисленные способы оценки функционального состояния системы гемостаза имеют один общий недостаток: они обеспечивают только выявление повышенной склонности тромбоцитов и сосудистой сценки к образованию тромбоцитарной пробки.

Задача изобретения - дооперационная диагностика функциональных нарушений системы гемостаза, которая определяет склонность к возникновению локальной кровоточивости в месте оперативного вмешательства.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что способ определения функционального состояния системы гемостаза, при котором осуществляют взятие крови сначала до, затем после создания кратковременной локальной ишемии с последующим смешиванием крови с антикоагулянтом, центрифугируют поэтапно до получения сначала богатой, затем бедной тромбоцитами плазмы, инкубируют, вводят индуктор агрегации в пробы, определяют параметр, характеризующий агрегацию до и после создания локальной ишемии, и по сравнению полученных результатов судят о функциональном состоянии системы гемостаза, введение индуктора агрегации осуществляют сначала с меньшей, затем с большей конечной концентрациями и фиксируют соответствующие им полученные значения степени агрегации, вычисляют по ним максимальные скорости агрегации до и после создания локальной ишемии отдельно для меньшей и большей концентраций индуктора агрегации, рассчитывают их соотношения, из полученных значений соотношений делают вывод: если величины отношений больше или равны 1, делают вывод о нормальной функциональной активности системы гемостаза, если значения этих отношений меньше 1, то - о гиперкоагуляционном изменении функционального состояния системы гемостаза, если одно значение отношения меньше 1, а другое больше или равно 1, то - о нарушении функционального состояния системы гемостаза и повышенном риске послеоперационной кровоточивости.

Способ позволяет выявить дооперационные нарушения функционирования системы гемостаза путем сравнения изменения значений максимальных скоростей агрегации тромбоцитов при двух конечных концентрациях индуктора агрегации в процессе проведения манжеточной пробы.

Заявляемый способ выполняют следующим образом.

Осуществляют взятие крови из кубитальной вены без наложения жгута с последующим смешиванием ее с антикоагулянтом в соотношении 9:1 соответственно. На другую руку накладывают манжету сфигмоманометра, определяют систолическое давление, повышают давление в манжете на 10 мм рт.ст. и через 3 мин. берут кровь в пробирку с антикоагулянтом, содержимое пробирки осторожно перемешивают. Кровь центрифугируют для получения богатой тромбоцитами плазмы в течение 10 минут при 1000-1500 об/мин., последнюю переносят в другую пробирку. Часть богатой тромбоцитами плазмы центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин, для получения бедной тромбоцитами плазмы. Исследования проводят на агрегометре. В основу устройства агрегометра положен принцип измерения светопропускания взвеси тромбоцитов, которое происходит при образовании агрегатов тромбоцитов под действием индукторов агрегации в богатой тромбоцитами плазме. В качестве индуктора агрегации используют, например, АДФ в двух конечных концентрациях - большей (A - 2•10^-5 М) и меньшей (C - 0,5•10^-5 М). В две чистые сухие кюветы помещают, соответственно, по 250 мкл богатой и бедной тромбоцитами плазмы. Вставляют в левое крайнее гнездо термостата прибора кювету с богатой тромбоцитами плазмой. В соседнее гнездо справа вставляют кювету с бедной тромбоцитами плазмой. На экране прибора появится произвольное число, меньше 100 и больше 0. Перемешивание богатой тромбоцитами плазмы осуществляют магнитной мешалкой. По истечении 1-2 мин. прогрева содержимого кювет до 37^oC нажимают кнопку "СБРОС" и, после прекращения изменения числа на экране прибора, нажимают кнопку масштабирования шкалы. На экране прибора появится число 00,0±2,0, что соответствует 0%-ой агрегации. После этого вводят в кювету с богатой тромбоцитами плазмой индуктор агрегации в конечной концентрации 2•10^-5 М. Фиксируют степень агрегации тромбоцитов через каждую минуту в течение 10 минут. Аналогичные исследования проводят для индуктора агрегации в конечной концентрации 0,5•10^-5 М. По полученным данным строят агрегатограммы. На оси абсцисс агрегатограммы откладывают время агрегации в минутах, на оси ординат - величину степени агрегации, выраженную в процентах. Вычисляют скорость максимальной агрегации (V), то есть отношение степени максимальной агрегации (MA, %) ко времени (t, мин.) ее достижения (V = MA/t). Затем вычисляют величины отношения максимальных скоростей агрегации тромбоцитов до ишемии и после ишемии при использовании соответственно меньшей (V_c до ишемии/V_c после ишемии) и большей концентрациях АДФ (V_a до ишемии/V_a после ишемии).

Если для двух конечных концентраций АДФ оба отношения одновременно больше или равны 1, то делают вывод о нормальной функциональной активности системы гемостаза, если значения этих отношений меньше 1, то - о гиперкоагуляционном изменении функционального состояния системы гемостаза, если одно значение меньше 1, а другое больше или равно 1, то - об нарушении функционального состояния системы гемостаза и повышенном риске послеоперационной кровоточивости.

Пример 1.

Б-ной Р. , 18 лет, поступил в институт по поводу остеохондромы нижней трети правой бедренной кости. До операции выполнена манжеточная проба с обработкой полученных данных традиционным и предлагаемым способом. Агрегационная способность тромбоцитов при большей конечной концентрации АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 80%, время ее наступления 1,5 мин, скорость максимальной агрегации 53,3%/мин. (80%:1,5 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов при меньшей конечной концентрации АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 75%, время ее наступления - 3 мин., скорость максимальной агрегации 25%/мин. (75%:3 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на большую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 139% время ее наступления 9 мин., скорость максимальной агрегации - 15,4%/мин. (139%:9 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на меньшую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 77%, время ее наступления - 4 мин., скорость максимальной агрегации - 19,3%/мин. (77%:4 мин.).

Агрегационная способность тромбоцитов при меньшей и большей конечных концентрациях АДФ до локальной ишемии соответствует норме. После создания локальной ишемии степень агрегации тромбоцитов на большую концентрацию АДФ увеличивается, хотя время достижения максимальной амплитуды удлиняется, агрегация на меньшую концентрацию остается без существенных изменений. Сделать вывод о нарушении агрегационной способности тромбоцитов, по полученным результатам, не представляется возможным.

По предлагаемому способу вычисляем отношения максимальных скоростей агрегации тромбоцитов, вызванной меньшей и большей концентрациями АДФ, до и после создания локальной ишемии. Отношение максимальных скоростей агрегации до и после ишемии при использовании меньшей концентрации агреганта составило 1,3 (25%/мин.: 19,3%/мин.), а при использовании большей концентрации АДФ 3,4 (53,3%/мин. :15,4%/мин.). Величины полученных отношений больше 1, что характеризует нормальную активность функционального состояния системы гемостаза и предполагает отсутствие возможности развития кровоточивости раны в послеоперационном периоде. Проведена операция: краевая резекция кости, удаление остеохондромы нижней трети правой бедренной кости. Послеоперационное течение протекало без осложнений.

Пример 2.

Б-ной А. , 57 лет, поступил в институт по поводу закрытого застарелого разрыва внутреннего мениска правого коленного сустава. До операции выполнена манжеточная проба с обработкой полученных данных традиционным и предлагаемым способом. Агрегационная способность тромбоцитов на большую концентрацию АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 77%, время ее наступления 8 мин. , скорость максимальной агрегации 9,6%/мин. (77%:8 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на меньшую концентрацию АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 165%, время ее наступления - 7 мин. , скорость максимальной агрегации - 23,6%/мин. (165%:7 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на большую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 65%, время ее наступления 5 мин, скорость максимальной агрегации - 13%/мин. (65%:5 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на меньшую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 120%, время ее наступления - 8 мин., скорость максимальной агрегации - 15%/мин. (120%:8 мин.).

Степень агрегации тромбоцитов на меньшую и большую концентрации АДФ до локальной ишемии соответствует норме, а время достижения максимальной амплитуды незначительно удлинено. После создания локальной ишемии наблюдали адекватную антиагрегационную реакцию со стороны тромбоцитов, активированных как меньшей, так и большей концентрациями АДФ: степень агрегации тромбоцитов на большую и меньшую концентрации индуктора агрегации уменьшилась, хотя время достижения максимальной амплитуды или незначительно сократилось (при использовании большей концентрации АДФ) или не изменилось (при использовании меньшей концентрации АДФ). Полученные данные не позволяют диагностировать нарушение агрегационной способности тромбоцитов, а следовательно, прогнозировать развитие геморрагического диатеза в послеоперационном периоде.

По предлагаемому способу вычисляем отношения максимальных скоростей агрегации тромбоцитов, вызванной меньшей и большей концентрациями АДФ, до и после создания локальной ишемии. Отношение максимальных скоростей агрегации до и после ишемии при использовании меньшей концентрации индуктора агрегации составило 1,6 (23,6%/мин. : 15%/мин. ), а при использовании большей концентрации АДФ - 0,7 (9,6%/мин. : 13%/мин.). В величинах отношений максимальных скоростей АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов до и после локальной ишемии выявлена разнонаправленность (отношение для большей концентрации меньше 1, а для меньшей концентрации - больше 1), что свидетельствует о нарушении функционального состояния системы гемостаза и возможности развития микроциркуляторного кровотечения в зоне оперативного вмешательства. Проведена операция - артротомия, удаление мениска правого коленного сустава. Послеоперационный период сопровождался накоплением крови в полости коленного сустава.

Пример 3.

Б-ая Б., 16 лет, поступила в институт по поводу повреждения внутреннего мениска левого коленного сустава. В дооперационном периоде проведена манжеточная проба с обработкой полученных данных традиционным и предлагаемым способом. Агрегационная способность тромбоцитов на большую концентрацию АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 100%, время ее наступления 7 мин, скорость максимальной агрегации 14,3%/мин. (100% : 7 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на меньшую концентрацию АДФ до локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 80%, время ее наступления - 6 мин. , скорость максимальной агрегации - 13,3%/мин. (80%:6 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на большую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 83% время ее наступления 4 минуты, скорость максимальной агрегации - 20,8%/мин. (83%:4 мин.). Агрегационная способность тромбоцитов на меньшую концентрацию АДФ после локальной ишемии: степень максимальной агрегации - 52%, время ее наступления - 2 мин., скорость максимальной агрегации - 26%/мин. (52%:2 мин.).

Степень агрегации тромбоцитов на меньшую и большую концентрации АДФ и время достижения максимальной амплитуды до локальной ишемии соответствуют норме. После создания локальной ишемии наблюдали гиперкоагуляционную реакцию со стороны тромбоцитов, активированных как меньшей, так и большей концентрациями АДФ: степень агрегации тромбоцитов на большую и меньшую концентрации индуктора агрегации уменьшилась при одновременном сокращении времени достижения максимальной амплитуды. Полученные данные свидетельствуют об изменении системы гемостаза и благоприятном прогнозе течения послеоперационного периода.

По предлагаемому способу вычисляют отношения максимальных скоростей агрегации тромбоцитов, вызванной меньшей и большей концентрациями АДФ, до и после создания локальной ишемии. Отношение максимальных скоростей агрегации до и после ишемии при использовании меньшей концентрации индуктора агрегации составило 0,5 (13,3%/мин. : 26%/мин.), а при использовании большей концентрации АДФ 0,7 (14,3%/мин. : 20,8%/мин.). Величины отношений максимальных скоростей АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов до и после локальной ишемии оказались меньше 1, что свидетельствует о гиперкаогуляционном изменении функционального состоянии системы гемостаза, обеспечивающим полноценную остановку кровотечения в сосудах микроциркуляторного русла.

Проведена операция - артротомия, удаление мениска левого коленного сустава, удаление хондроматозного тела. Послеоперационный период протекал без особенностей.

Медико-клиническая эффективность предлагаемого способа заключается в возможности проведения дооперационной диагностики нарушений функционального состояния системы гемостаза, что позволяет прогнозировать развитие геморрагического диатеза в области оперативного вмешательства, а следовательно, проводить своевременную профилактику данного осложнения.

Способ может быть использован в медицине, а именно в гемокоагулологии, а также для выявления лиц с повышенным риском возникновения локального послеоперационного геморрагического диатеза. У больного осуществляют взятие крови сначала до, затем после создания кратковременной локальной ишемии с последующим смешиванием крови с антикоагулянтом. Центрифугируют смесь поэтапно до получения сначала богатой, затем бедной тромбоцитами плазмы, инкубируют, вводят индуктор агрегации в пробы, затем определяют параметр, характеризующий агрегацию до и после создания локальной ишемии, и по сравнению полученных результатов судят о функциональном состоянии системы гемостаза. Введение индуктора агрегации осуществляют сначала с меньшей, затем с большей конечной концентрациями и фиксируют соответствующие им полученные значения степени агрегации, вычисляют по ним максимальные скорости агрегации до и после создания локальной ишемии отдельно для меньшей и большой концентраций индуктора агрегации, рассчитывают их соотношения. Из полученных значений соотношений делают вывод: если величины отношений больше или равны 1, делают вывод о нормальной функциональной активности системы гемостаза, если значения этих отношений меньше 1, то - о гиперкоагуляционном изменении функционального состояния системы гемоcтаза, если одно значение отношения меньше 1, а другое больше или равно 1, то - о нарушении функционального состояния системы гемостаза и повышенном риске послеоперационной кровоточивости. Способ позволяет провести дооперационную диагностику функциональных нарушений системы гемостаза, что позволяет прогнозировать развитие геморрагического диатеза в области оперативного вмешательства и проводить своевременную профилактику данного осложнения.

Способ определения функционального состояния системы гемостаза, при котором осуществляют взятие крови сначала до, затем после создания кратковременной локальной ишемии с последующим смешиванием крови с антикоагулянтом, центрифугируют поэтапно до получения сначала богатой, затем бедной тромбоцитами плазмы, инкубируют, вводят индуктор агрегации в пробы, определяют параметр, характеризующий агрегацию до и после создания локальной ишемии, и по сравнению полученных результатов судят о функциональном состоянии системы гемостаза, отличающийся тем, что введение индуктора агрегации осуществляют сначала с меньшей, затем с большей конечной концентрациями и фиксируют соответствующие им полученные значения степени агрегации, вычисляют по ним максимальные скорости агрегации до и после создания локальной ишемии отдельно для меньшей и большей концентраций индуктора агрегации, рассчитывают их соотношения, из полученных значений соотношений делают вывод: если величины отношений больше или равны 1, делают вывод о нормальной функциональной активности системы гемостаза, если значения этих отношений меньше 1, то - о гиперкоагуляционном изменении функционального состояния системы гемостаза, если одно значение отношения меньше 1, а другое больше или равно 1, то - о нарушении функционального состояния системы гемостаза и повышенном риске послеоперационной кровоточивости.