ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ЛИСТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Преимущественная область использования - ветеринария.

Аналогом изобретения является монография академика РАСХНИЛ Бакулова И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных М. 1967 с. 236, где указано, что ".. . задача вакцинации может быть решена с помощью живых вакцин из аттенуированных штаммов..., при создании средств специфической профилактики нужно учитывать антигенное различие штаммов. Вакцина должна быть поливалентной или состоять хотя бы из двух штаммов, являющихся представителями двух серогрупп".

Прототипом изобретения является живая, листериозная вакцина. Для ее создания использовали вирулентный штамм "А" подвергнутый воздействию ультрафиолетовых лучей. По результатам мутации штамм был типирован как вакцинный аттенуированный штамм "АУФ", относящийся к 1 серологической группе листерий. Вакцина представляет собой сухую, мелкозернистую массу, беловатого цвета, хорошо растворимую в воде. Иммуногенность вакцины определяют на морских свинках, которым вводят однократно внутрибрюшинно бактериальную суспензию дозой 10 млрд. м.т. Через 11 - 12 дн этих животных заражают в дозе 3LД₅₀ исходным вирулентным штаммом "А". Вакцина признается активной, если в течение 15 дн останутся живыми не менее 7 из 10 вакцинированных морских свинок, при гибели не менее 7 из 10 контрольных животных. (Справочник Ветеринарные препараты, М., 1981, с. 256).

Основные недостатки прототипа заключаются в следующем: в конструкцию вакцины введен листериозный штамм только 1 серогруппы, т.е. в нее включены антигенные детерминанты с 1 по 3 серовариантов включительно, а антигенные детерминанты II серогруппы включающие сероварианты от 4а до 7, не присутствуют в данной вакцине, что создает возможность прорыва иммунитета у вакцинированного животного эпизоотическим штаммом II серогруппы.

Контроль иммуногенности проверяют путем заражения иммунизированных животных, родственным по антигенной структуре, листериозным штаммом "А" - исходный, что не позволяет реально оценить протективные свойства вакцины.

Используемый вакцинный штамм "АУФ" является реверсибельным. За последние несколько лет участились случаи заболевания животных после их вакцинации. Данная закономерность привела к тому, что по решению Главного ветеринарного управления указанная вакцина используется только в хозяйствах неблагополучных по листериозу. В угрожаемых районах, где листериоз не регистрируется, вакцину не применяют, т.к. стремятся предотвратить появление стационарного очага листериоза, возникающего после использования данной вакцины. Реверсибельность штамма можно объяснить ненадежностью генетической мутации.

Целью изобретения является вакцина бивалентная, сухая против листериоза сельскохозяйственных животных, изготовленная из бактерий листериозных штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52, относящихся к I и II серогруппам соответственно, и обладающая широким диапазоном антигенных детерминант входящих в обе серогруппы и продуцирующих иммунитет против эпизоотических штаммов обеих серогрупп.

Сущность изобретения заключается в использовании в качестве вакцинного препарата живых авирулентных листериозных бактерий штаммов УСХИ-19 (I серогруппы) и УСХИ-52 (II серогруппы), обладающих широким диапазоном антигенных детерминант.

Отличительными существенными признаками объекта изобретения являются следующие.

1. В предлагаемом вакцинном препарате протективными свойствами обладает конструкция, состоящая из авирулентных листериозных бактерий двух штаммов I и II серогрупп. Это позволяет использовать при создании иммунитета против листериозной инфекции 16 соматических антигенных детерминант с 1 до 7 сероваров. Вакцина-прототип использует в конструкции один аттенуированный листериозный штамм I серогруппы, тем самым она включает в себя 6 соматических антигенных детерминант диапазона 1 - 3 сероваров и не может создавать полноценный иммунитет против эпизоотических листериозных штаммов II серогруппы.

2. Предлагаемый вакцинный препарат состоит из авирулентных штаммов природного происхождения, не являющихся реверсибельными.

Вакцина-прототип состоит из искусственно полученного - путем ультрафиолетового облучения вирулентного штамма "А", аттенуированного штамма "АУФ", что создает возможность реверсии бактериальной культуры.

З. Иммуногенные свойства предлагаемой вакцины доказаны путем контрольного заражения вирулентными штаммами листерий I и II серогрупп.

Иммуногенные свойства вакцины-прототипа подтверждены путем клострального заражения родственным по антигенному составу, исходным вирулентным штаммом.

Пример контрольного выполнения изобретения. Вакцина бивалентная сухая, живая против листериоза сельскохозяйственных животных представляет собой лиофилизированную культуру Listerna monocytogenes, штаммов УСХИ-19 (I серогруппа) и УСХИ-52 (II серогруппа). Культуры указанных листериозных штаммов хорошо растут в мясо-пептонном бульоне (МПБ) при ЗО^oC. МПВ в первые сутки слегка мутнеет. Помутнение равномерное, при встряхивании пробирки наблюдаются так называемые муаровые волны. Через 2 - 4 сут бульон в пробирке светлеет, а на дне ее образуется слизистый осадок, который при встряхивании поднимается косичкой.

На мясопептонной желатине (МПЖ) при посеве уколом культуры листерий дают через двое суток рост в виде штыка только по ходу укола, не наблюдается отростков и разжижения желатины.

В бульоне Китт-Тароцци рост листерий характеризуется очень слабым помутнением среды.

На мясопептонном агаре (МПА) в первые сутки роста - колонии мелкие (0,2 - 0,5 мм в диаметре), прозрачные в проходящем свете, слегка выпуклые. Через 2 - 3 сут колонии увеличиваются в размере (до 1 - 3 мм в диаметре), становятся более плоскими и приобретают сероватый оттенок при падающем свете.

Морфология. В мазках культур листериозных штаммов, приготовленных с МПБ и МПА, окрашенных по Граму, бактерий грамположительные полиморфные палочки. Они располагаются единично, парами, небольшими цепочками.

Подвижность. Суточные бульонные культуры изученных листериозных штаммов при просмотре под микроскопом в висячей капле - подвижны.

Биохимические свойства. Культуры изученных штаммов ферментируют с образованием кислоты без газа, глюкозу, мальтозу, салицин, эскулин, фруктозу, обеспечивают лакмусовое молоко, индол не образуют, выделяют каталазу, реакция Фогес-Проскауэра положительная.

Серологические свойства. По результатам постановки пробы роста и реакции агглютинации с серогрупповыми сыворотками, а также пробы с фагами ВНИИВВиМ штамм УСХИ-19 отнесен к I серогруппе, штамм УСХИ-52 к II серогруппе.

Токсинообразование. На кровяном агаре не вызывали гемолиза.

Вирулентные свойства. Культуры штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52 не вызывают гибель кроликов при внутрибрюшинном введении в дозе 20 млрд. клеток. После 10 пассажей на белых мышах культуры указанных штаммов не вызывают гибель кроликов при внутрибрюшинном введении в указанной дозе.

Иммуногенные свойства. Культурами штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52 были привиты по 20 морских свинок в дозе 10 млрд. клеток. Через 10 дн по 10 привитых каждым штаммом животных были заражены вирулентными листериозными штаммами N 766 (1 серогруппа) и 634 (2 серогруппа) в дозе 10 млрд. клеток.

Из 10 вакцинированных штаммом УСХИ-19 морских свинок пало от штамма 766 - 2 головы, а от штамма 634 - 5 голов.

Из 10 вакцинированных штаммом УСХИ-52 морских свинок пало от штамма 766 - 6 голов, а от штамма 634 - 1 голова.

По внешнему виду эта вакцина сухая, аморфная или мелко кристаллическая масса светло-желтого или серовато-беловатого цвета с мелкопористой структурой. Вакцину выпускают в ампулах или флаконах, в которых содержится, соответственно 4 см³ и 10 см³ вакцины. Флаконы укупорены резиновой пробкой и обкатаны металлическими колпачками. На стекло нанесена маркировка со следующими обозначениями: номер серии, количество доз, дата изготовления, срок годности.

Использование: биотехнология, ветеринарная микробиология, профилактика листериоза, вакцина. Сущность изобретения: вакцина бивалентная, сухая, живая против листериоза сельскохозяйственных животных содержит листериозные штаммы УСХИ-19, УСХИ-52, относящиеся к 1 и II серогруппам соответственно. Вакцина обладает широким диапазоном антигенных детерминант, входящих в обе серогруппы и создает иммунитет против эпизоотических штаммов обеих серогрупп.

Живая вакцина против листериоза сельскохозяйственных животных, содержащая авирулентные штаммы Listeria monocytogenes, отличающаяся тем, что из авирулентных листерий она содержит штамм Listeria monocytogenes УСХИ-19 Деn (I серогруппы) и штамм Listeria monocytogenes УСХИ-52 Деn (II серогруппы).