СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СРЕДСТВА Российский патент 1998 года по МПК A61K45/05 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно, к технологии получения лекарственных средств и препаратов на основе растительного сырья, обладающих противоопухолевой активностью, и может быть также использовано и в ветеринарии.

Известен способ получения препарата, обладающего противораковой (противоопухолевой) активностью [1], включающий культивирование штамма Bacillus thurindiensis, подготовку культуры, удаление спор из споро-дельта-эндотоксиновой смеси при помощи флотации и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов с использованием ультрафиолетового излучения.

Известен также способ получения противоракового (противоопухолевого) средства [2], выбираемый в качестве прототипа, который включает культивирование штамма Bacillus thuringiensis Var. gallerie (исходное биологическое сырье), подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов (активные элементы). Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали.

Основным недостатком противоопухолевых средств, получаемых м помощью технологий аналога и прототипа, а также и других известных на сегодняшний день противоопухолевых средств является то, что при своем воздействии на опухоль, последняя успевает вырабатывать ингибиторы, которые инактивируют Т-лимфоциты и гуморальные антитела, в результате чего активные элементы препаратов теряют ориентир своей мишени и разрушаются ферментным шквалом ("блокирующий фактор"), а опухоль остается неуязвимой. Известные методы воздействия непосредственно на раковую клетку также лишь затормаживают развитие ракового процесса. Кроме того, все известные средства обладают токсическими свойствами и в большинстве своем обладают побочными эффектами.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение нетоксичного иммуномодулирующего средства, обладающего свойства стимулировать неспецифический иммунитет, способствующий повреждению ингибиторной системы и защитных барьеров раковых клеток, не повреждая при этом здоровые клетки, а также восстанавливать подавленную опухолью активность и результативность Т-клеточного и гуморального иммунитета.

Поставленная задача достигается за счет того, что в известном способе получения противоопухолевого средства, включающем культивирование активных элементов на исходном биологическом сырье, отделение жидкой фракции и фильтрацию, согласно изобретению в качестве исходного биологического сырья используют чистотел или другие симбиозные растения, обладающие природным противоопухолевым эффектом, культивирование активных элементов осуществляют путем многоступенчатой ферментации, первая стадия которой осуществляется в течение 5 - 6 нед при температуре исключающей подсушивание или гниение биомассы с последующим ее измельчением, вторая стадия ферментации осуществляется в течение 10 - 14 дн при температуре 32 - 38^oC, третья стадия ферментации осуществляется при температуре 28 -35^oC в течение 3 - 4 мес, а четвертая стадия ферментации осуществляется при температуре 4 - 8^oC в течение 7 - 9 мес, при этом после первой и четвертой стадии ферментации осуществляют кипячение ферментированного сырья в течение 1,5 - 2 ч, отделение жидкой фракции осуществляется после второй стадии ферментации, а фильтрация осуществляется после отделения жидкой фракции и после четвертой стадий ферментации.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят сбор симбиозных растений (например чистотел большой, молочайник еловидный, осот желтый и др., изначально обладающих природным противоопухолевым эффектом) в определенной стадии вегетации. Растения должны собираться в экологически чистых районах, не подвергавшихся каким либо химическим загрязнения.

Растения, используемые в качестве исходного сырья, относятся к симбиозным растениям, т.е. к растениям, ведущим совместное сосуществование (симбиоз) с некоторыми видами микроорганизмов. Этот симбиоз обеспечивает растениям изначальный природный противоопухолевый эффект. Случаи излечения такими растениями известны и писаны в медицинской литературе (Соколов С.Я., Замотаев И. П. , Справочник по лекарственным растениям. Фитотерапия, М. Металлургия, 1990, с.153 - 55. Пастушенков Л.В., Пастушенков А.Л. Лекарственные растения. Использование в народной медицине и быту. Л., Лениздат, 1990, с.291 - 292). В приведенных источниках информации описано применение свежего сока (млечного сока) или мази из травы растения (чистотела) для излечения рака кожи и кондилом (предраковое заболевание). Известны также случаи излечения онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта отварами сухой травы и едким соком живого чистотела. Еще в конце девятнадцатого века были сделаны предположения о том, что чистотел (или другие, сходные с ним, симбиозные растения) может быть использован в качестве основы противоопухолевого средства.

Однако опыт многовекового использования указанных растений с лечебной целью показал, что не при всех, а лишь при некоторых формах приготовления из них лечебных средств, проявлялся противоопухолевый эффект.

Учитывая известные противоопухолевые свойства чистотела, его симбиозную структуру, а также богатейший биохимический состав, пришла идея найти такой метод приготовления противоопухолевого средства, который мог бы обеспечить максимальный выход активных элементов, стимулирующих противоопухолевый эффект.

Задача решается культивированием активных элементов путем длительной многоступенчатой ферментации исходного сырья, представляющего собой биомассу собранных симбиозных растений, изначально обладающих противоопухолевыми свойствами. Ферментация сопровождается многократным изменением температурного режима исходного сырья в результате чего происходит сложный процесс микробной пере6работки исходного сырья, при котором микрофлора существенно изменяется от стадии к стадии до полного естественного созревания натурального нетоксичного противоопухолевого растительно-микробно-фагового средства.

Первая стадия ферментации осуществляется в течение 5 - 6 нед в температурном режиме, при котором исключается подсушивание или гниение биомассы. Первая стадия закачивается когда растительная масса приобретает коричнево-оранжевый цвет. Затем ферментированное сырье измельчается и кипятится в течение 1,5-2 ч.

Вторая стадия ферментации твердо-жидкой фракции сырья осуществляется в течение 10 - 14 дн при температуре 32 - 38^oC. Признак окончания этой стадии - ферментируемое сырье приобретает острый запах хрена. Остатки твердого сырья отделяются от жидкой фракции и жидкая фракция фильтруется. Фильтрование быстрое через асбестовый фильтр, на поверхность которого помещается мембранный фильтр N 4.

Третья стадия ферментации осуществляется при температуре 28 - 35^oC в течение 3 - 4 мес. Данная стадия ферментации характеризуется запахом скотного двора, образованием на поверхности жидкой среды слизистой пленки, которая постепенно истончается, затем переходит в черную подсушенную и оседает на дно емкости. Запах культуральной среды ослабевает, изменяется и приобретает запах сероводорода. Сырье осторожно деканируется в чистые емкости.

Четвертая стадия ферментации осуществляется при температуре 4 - 8^oC в течение 7 - 9 мес. В течение этой стадии происходит дозревание культуральной среды.

Момент созревания противоопухолевого средства совпадает с осветлением жидкой культуральной среды, сопровождаемое полным выходом в среду активных элементов, которые к этому моменту лизируют большинство всех прочих микроорганизмов, преимущественно прямо или через ферменты, индуцируемые в лизируемых бактериях.

Полученная жидкая культуральная среда темно-коричневого цвета со слабым запахом сероводорода фильтруется, кипятится в течение 1,5 - 2 ч. и герметично укупоривается. =Затем осуществляются стандартные операции для лекарственных средств, получаемых методом ферментации: микробиологические исследования полученного лекарственного средства, расфасовка в стеклянные флаконы и укупорка резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками, пастеризация препарата на водяной бане, выборочный микробиологический контроль лекарственного средства, готового к применению, маркировка серии.

Полученное вещество представляет собой растительно-микробно-фаговое противоопухолевое средство (названное авторами "рамифар"), обладающее иммуномодулирующими свойствами.

Мощный иммунный ответ организма, на введение приготовленного по предлагаемой технологии лекарственного средства, позволяет организму опередить блокирующий фактор опухоли, не позволить раковым клеткам успеть выработать ингибиторы против введенного средства, в результате опухоль становится узнаваемой и уязвимой мишенью для активных противоопухолевых элементов средства, а также для Т-клеток и гуморальный антител, восстанавливает подавленный опухолью противоопухолевый эффект и обусловливает успешную борьбу с опухолевым процессом. В этом заключается основное преимущество полученного противоопухолевого средства перед известными в настоящее время препаратами и биологическими мишенями, сталкиваясь с которыми, опухоль успевает выработать ингибиторы, инактивировать Т-клетки и гуморальные антитела и разрушить их ферментным шквалом (блокирующий фактор), в результате опухоль остается неузнаваемой, а раковый процесс продолжается. Известные методы воздействия непосредственно на раковые клетки также лишь затормаживают развитие ракового процесса. Кроме того, все известные противоопухолевые средства, обладают токсическими свойствами и побочными эффектами.

Исследования, проведенные в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН на острую токсичность полученного по предлагаемому способу противоопухолевого средства и его воздействия на иммунную, ге6мопоэтическую системы и систему интерферона показали, что средство:
не обладает токсическими свойствами;
вызывает сильную активацию лимфоидных клеток и усиливает продукцию целого ряда цитокинов (интерлейкинов-1 и -2, фактора некроза опухолей - aльфа, интерферона), что позволяет сделать заключение о наличии у него иммуномодулирующих свойств, стимулирующих неспецифический иммунитет,
не оказывает возмущающего воздействия на гемопоэтическую систему, что позволяет отнести его к иммуномодуляторам, не обладающим побочным действием на лимфогемопоэз;
в исследованной тест-системе у полученного противоопухолевого средства отсутствуют адъювантные свойства.

В отчете подчеркнуто, что в целом полученные данные свидетельствуют о наличии в исследованном средстве чрезвычайно ценных иммуномодулирующих свойств, что наряду с низкой токсичностью позволяет рассматривать его в качестве перспективного противоопухолевого и противоинфекционного средства.

Кроме того, одним из существенных преимуществ полученного противоопухолевого средства является то, что его терапевтическая доза в 100 раз ниже дозы, вызывающей видимые изменения внутренних органов.

Источники информации:
1. Lamola B. et fl. Photochemistry and photobiology 1985 v. 41, N 3, p. 361-365.

2. Патент СССР N 1790410 МПК A 61 K 35/74, 1991 г.

Использование: в медицине и медицинской промышленности, а именно, в технологии получения лекарственных средств и препаратов на основе растительного сырья, обладающих противоопухолевой активностью, может быть также использовано в ветеринарии. Сущность изобретения: растительно -микробно-фаговое противоопухолевое средство получают путем длительной многоступенчатой ферментации исходного сырья, представляющего собой чистотел или биомассу других симбиозных растений, изначально обладающих природными противоопухолевыми свойствами. Первую стадию ферментации осуществляют в течение 5 - 6 нед при температуре, исключающей подсушивание или гниение биомассы с последующим ее измельчением, вторую стадию в течение 10 - 14 дней при температуре 32 -38^oC, третью стадию при температуре 28 - 35^oC в течение 3 -4 мес, а четвертую стадию при температуре 4 - 8^oC в течение 7 - 9 мес, при этом после первой стадии ферментации осуществляют кипячение ферментированного сырья в течение 1,5 - 2 ч, отделение жидкой фракции осуществляется после второй стадии ферментации, фильтрацию осуществляют после отделения жидкой фракции и после четвертой стадии ферментации проводят фильтрацию с последующим кипячением. Технический результат: уменьшение токсичности и усиление иммуномодулирующих свойства.

Способ получения противоопухолевого средства, включающий культивирование микроорганизмов на исходном сырье и отделение жидкой фракции, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют чистотел или другие симбиозные растения, обладающие природным противоопухолевым эффектом, культивирование микроорганизмов осуществляют путем многоступенчатой ферментации, первую стадию которой осуществляют в течение 5 6 недель при температуре, исключающей подсушивание или гниение биомассы с последующим ее измельчением, вторую стадию ферментации осуществляют в течение 10 14 дней при 32 38^oС, третью стадию ферментации осуществляют при 28 35^oС в течение 3 4 месяцев, четвертую стадию ферментации осуществляют при 4 8^oС в течение 7 9 месяцев, при этом после первой стадии ферментации осуществляют кипячение ферментированного сырья в течение 1,5 2 ч, отделение жидкой фракции для ее дальнейшей переработки осуществляют после второй стадии ферментации, после отделения жидкой фракции осуществляют фильтрацию и после четвертой стадии ферментации осуществляют фильтрацию с последующим кипячением.