Способ получения биопрепарата из вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), обладающего противоопухолевой активностью Российский патент 2024 года по МПК A61K36/23 B01D11/02 A61P35/00 

Изобретение относится к области биохимии и фармацевтической промышленности, а именно к способу получения препарата на основе биологически активных веществ сухого раствора вздутоплодника сибирского (лат. Phlojodicarpus sibiricus), обладающего противоопухолевым эффектом.

Известно, что полифенолы природного происхождения оказывают протективное действие в отношении развития опухолей органов ротовой полости, желудка, двенадцатиперстной кишки, печени, легких, кожи, яичников, шейки матки, молочной и предстательной желез (см. Amararathna M., Johnston M.R., Rupasinghe H.P.V. Plant polyphenols as chemopreventive agents for lung cancer. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17 (8): 1352. DOI: 10.3390/ijms 17081352; Amin A.R.M.R., Kucuk O., Khuri F.R., Shin D.M. Perspectives for cancer prevention with natural compounds. J. Clin. Oncol. 2009; 27 (16): 2712-2725. DOI: 10.1200/jco.2008.20.6235; Kozlowska A., Szostak-Wegierek D. Flavonoids - food sources and health benefits. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 2014; 65 (2): 79-85; Li Q., Ren F.Q., Yang C.L., Zhou L.M., Liu Y.Y., Xiao J., Zhu L., Wang Z.G. Anti-proliferation effects of isorhamnetin on lung cancer cells in vitro and in vivo. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2015; 16 (7): 3035-3042. DOI: 10.7314/apjcp.2015.16.7.3035; Pandey K.B., Rizvi S.I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human htalth and disease. Oxid. Med. Cell. Long. 2009; 2 (5): 270-278. DOI: 10.4161/oxim.2.5.9498; Pratheeshkumar P., Sreekala C., Zhang Z., Budhraja A., Ding S., Son Y.O., Wang X., Hitron A., Kim H.J., Wang L., Lee J.C., Shi X. Cancer prevention with promising natural products: Mechanisms of action and molecular targets. Anticancer Agents Med. Chem. 2012; 12 (10):1159-1184. DOI: 10.2174/187152012803833035; Romano B., Pagano E., Montanaro V., Fortunato A.L., Milic N., Borrelli F. Novel insights into the pharmacology of flavonoids. Phytother. Res. 2013; 27 (11): 1588-1596. DOI: 10.1002/ptr. 5023; Sak K. Cytotoxicity of dietary flavonoids on different human cancer types. Pharmacogn. Rev. 2014; 8 (16): 122-146. DOI: 10.4103/0973-7847.134247, 18. Johnson I.T., Williamson G., Musk S.R.R. Anticarcinogenic factors in plant foods: A new class of nutrients. Nutr. Res. Rev. 1994; 7 (1): 175-204. DOI: 10.1079/nrr19940011; Zhou Y., Zheng J., Li Y., Xu D.P., Li S., Chen Y.M., Li H.B. Natural polyphenols for prevention and treatment of cancer. Nutrients. 2016; 8 (8): E515. DOI: 10.3390/nu 8080515).

В частности, флавоноиды способны ингибировать три этапа развития раковых клеток: инициирование - влияние на оксидативный стресс и инактивацию канцерогенов; активирование (промоцию) - ингибирование клеточной пролиферации и распространение - активация апоптоза, ингибировании ангиогенеза и подавлении метастазирования опухоли (см. Chachar M.K., Sharma N., Dobhal M.P., Joshi Y.C. Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs. Pharmacogn. Rev. 2011; 5 (9): 1-12. DOI: 10.4103/0973-7847.79093; Kandaswami C., Lee L.T., Lee P.P., Hwang J.J., Ke F.C., Huang Y.T., Lee M.T. The antitumor activities of flavonoids. In Vivo. 2005; 19 (5): 895-909, Sak K. Cytotoxicity of dietary flavonoids on different human cancer types. Pharmacogn. Rev. 2014; 8 (16):122-146. DOI:10.4103/0973-7847.134247; Kilani-Jaziri S., Frachet V., Bhouri W., Ghedira K., Chekir-Ghedira L., Ronot X. Flavones inhibit the proliferation of human tumor cancer cell lines by inducing apoptosis. Drug. Chem. Toxicol. 2012; 35 (1): 1-10. DOI: 10.3109/01480545.2011.564180; Kozlowska A., Szostak-Wegierek D. Flavonoids - food sources and health benefits. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 2014; 65 (2): 79-85; Li A.N., Li S., Zhang Y.J., Xu X.R., Chen Y.M., Li H.B.Resources and biological activities of natural polyphenols. Nutrients. 2014; 6 (12): 6020-6047. DOI: 10.3390/nu6126020; Li F., Li S., Li H.B., Deng G.F., Ling W.H., Wu S., Xu X.R., Chen F. Antiproliferative activity of peels, pulps and seeds of 61 fruits. J. Funct. Foods. 2013; 5 (3): 1298-1309. DOI: 10.1016/j.jff.2013.04.016; Li F., Li S., Li H.B., Deng G.F., Ling W.H., Xu X.R. Antiproliferative activities of tea and herbal infusions. Food Funct. 2013; 4 (4): 530-538. DOI: 10.1039/c2fo30252g; Majewski G., Lubecka-Pietruszewska K., Kaufman-Szymczak A., Fabianowska-Majewska K. Anticarcinogenic capabilities of plant polyphenols: Flavonoids and stilbene. Pol. J. Public Health. 2012; 122 (4): 434-439. DOI: 10.12923/j.0044-2011/122-4/a.19; Mantena S.K. Grape seed proanthocyanidins induce apoptosis and inhibit metastasis of highly metastatic breast carcinoma cells. Carcinogenesis. 2005; 27 (8):1682-1691. DOI: 10.1093/carcin/bgl030; Middleton E.Jr., Kandaswami C., Theoharidis T.C. The effects of plant flavonoids on mammalian biology: Implications for inflammations, heart disease and cancer. Pharmacol. Rev. 2000; 52 (4): 673-751; Pandey K.B., Rizvi S.I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human htalth and disease. Oxid. Med. Cell. Long. 2009; 2 (5): 270-278. DOI: 10.4161/oxim.2.5.9498).

Известно, что присутствие радикалов в клетках организма связано с процессами жизнедеятельности и играет важную роль в прооксидантно-антиоксидантном равновесии. Окислительное повреждение является результатом эндогенных и экзогенных факторов образования активных форм кислорода. К числу внутренних источников окислителей относят митохондриальную электронно-транспортную цепь и реакцию синтеза синтазы оксида азота, а также немитохондриальные реакции (см. Gilca M., Stoian I., Atanasiu V., Virgolici B. The oxidative hypothesis of senescence. // J. Postgrad. Med. 2007. № 53(3). Р. 207-213).

Чрезмерное образование свободных радикалов вызывает угнетение естественной клеточной антиоксидантной защиты и приводит к ухудшению функциональности организма (см. Poljsak B., Milisav I. Aging, oxidative stress and antioxidants. In: J.A. Morales-González (Ed.), Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases. A Role for Antioxidants, Intech Open Access Publisher, Croatia. 2013. Р. 331-356 doi: 10.5772/51609).

В качестве одной из важнейших стратегий снижения окислительного стресса выделяют потребление экзогенных антиоксидантов, как правило, растительного происхождения (см. Ames B.N, Shigenaga M.K, Hagen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci USA. 1993, 90. Р. 7915-7922; Packer L. Oxidative stress, antioxidants, aging and disease. In: Cutler R.G., Packer L., Bertram J., Mori A. (eds) Oxidative Stress and Aging. Molecular and Cell Biology Updates. Birkhäuser Basel. 1995. Р. 1-14. doi.org/10.1007/978-3-0348-7337-6_1).

Таким образом, известно средство для лечения онкологических заболеваний (см. RU №2118166, кл. А61К 35/78, опубл. 27.08.1998), содержащее водные экстракты растений родов Geranium, Plantago и растения вида Calendula officinalis, полученные при следующем соотношении растений и воды, г: Geranium - 10-60 (сух.) или 300-360 (свеж.), Plantago - 10-60 (сух.), Calendula officinalis - 10-60 (сух.), вода - 3000. Средство может дополнительно содержать экстракт растения вида Pentaphilloides fruticosa, полученный из 10-60 г (сух.), а также экстракт растения рода Angelica, полученный из 10-60 г (сух.). Способ получения водных экстрактов заключается в вымачивании в воде с последующим процеживанием и центрифугированием.

Недостатками известного решения является получение экстракта путем мацерации без использования асептических условий, что приводит к снижению сроков хранения и увеличению микробиологической нагрузки организма при применении.

В Сибири и Якутии известно использование вздутоплодника сибирского как пищевого и лекарственного растения, обладающего широким терапевтическим действием: отвар корней вздутоплодника сибирского применяли при ожирении, туберкулезе легких, заболеваниях щитовидной железы, желудка и сердца, ревматизма, атеросклероза, при лечении ран и опухолях желудка и пищевода (см. Атлас лекарственных растений Якутии / Сост. Л.В. Кузнецова, Л.Г. Михалева, В.И. Захарова и др.; Отв. ред. Б.И. Иванов. - Якутск: Изд-во ЯНЦ СО РАН, 2003. - 224 с.; Баторова С.М., Яковлев Г.П., Асеева Т.А. Справочник лекарственных растений традиционной тибетской медицины. Новосибирск: Наука, 2013. С. 127-129; Barnaulov, O.D.; Belenovskaya, L.M.; Medvedeva, L.I. (Eds.) Plant Resources of USSR: Flowering Plants, Chemical Components, Uses-Family Rutaceae-Elaegnaceae; Nauka: Leningrad, Russia, 1988; pp. 150-152. Или Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Rutaceae - Elaegnaceae. Л., 1988. 357 с.).

Ранее использовали вздутоплодник сибирский в фармацевтике при производстве препаратов димидина, фловерина и сафинора, которое приостановлено по причине сокращения численности популяций и, соответственно, отсутствия сырья (см. Васильева О.Д. Вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus Sibiricus (Steph. ex Spreng.) K.- Pol. в Якутии: Биология, интродукция, охрана. Диссертация ... кандидата биологических наук. Якутск, 2005. 170 с.; Громакова А.И., Исайкина А.П., Кривут Б.А., Вандышев В.В. Изучение содержания виснадина и дигидросамидина в сырье вздутоплодника сибирского // Хим. -фарм. журн. 1982. Т. 16. № 4. С. 60-66; Пименов М.Г., Бабилев Ф.В., Никонов Г.К. Phlojodicarpus Turcz. и Libanotis L. Как источники получения кумаринов со спазмолитической активностью // Растительные ресурсы. 1968. Т.4. №4. С. 486-491).

При этом решения для получения известных препаратов характерны следующими недостатками:

- отсутствуют результаты исследований микробиологической обсемененности препаратов;

- многокомпонентный состав препаратов представляет сложность в их стандартизации при фитохимических исследованиях, что может приводить к удорожанию себестоимости при сборе биосырья и значительному увеличению затрат при изготовлении биопрепаратов, обусловленные проведением анализов.

Некоторыми подходами для выхода из сложившегося положения в отсутствии сырья для приготовления биопрепаратов, возможно, станет создание питомников лекарственных растений и использование надземной биомассы сырья.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в получении биопрепарата на основе вздутоплодника сибирского, обладающего противоопухолевой активностью.

Технический эффект, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в получении биопрепарата на основе вздутоплодника сибирского путем использования надземной части биомассы, что не представляет угрозы сокращения популяции многолетнего растения.

Для решения поставленной задачи способ получения экстракта надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) характеризуется тем, что в качестве сырья используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), собранную в период цветения, а именно, листья, стебли и цветки, при этом предварительно высушенное и измельченное сырье при соотношении сырье-экстрагент 1:10 последовательно экстрагируют водными растворами этанола при температуре 23-25°С в течение 22-24 часов на каждом этапе по следующей схеме: вначале 70% раствором, после чего, 90% раствором, затем, снова 70% раствором, после чего, 90% раствором, и в завершении снова 70% раствором, полученные этанольные экстракты объединяют и упаривают в испарителе при температуре 50±2°С, до получения водной фракции, водный концентрат подвергают лиофильному высушиванию на лиофилизаторе до полного удаления растворителя и получения сухого остатка. Кроме того, для экстрагирования растительного сырья повторно используют отгон от водно-этанольной экстракции. Полученный сухой экстракт хранят в холодильнике в герметичной упаковке. Кроме того, экстракт надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), полученный вышеуказанным способом, применяют в качестве биопрепарата, обладающего противоопухолевым действием.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, расширение ассортимента биопрепаратов, обладающих противоопухолевой активностью, и способов их получения. При этом получают лиофилизированный экстракт, способный подавлять рост раковых клеток HepG2, который может найти применение для подавления опухолевого роста как отдельно, так и совместно с иными препаратами при комплексном лечении.

Сущность заявленного изобретения состоит в том, что для приготовления биопрепарата (рабочее название «Флодис») используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского, собранную в период цветения. Для экспериментов использовали растение, выращенное в питомнике на территории Ботанического сада Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (ИБПК, Республика Саха (Якутия), г. Якутск). Высушивание надземной биомассы проводили в комнатных условиях без доступа света. Экстрагирование осуществляли последовательно водно-этанольными 70% (трёхкратно) и 96% (двухкратно) растворами. Экстракты объединяли, упаривали на роторном испарителе до водной фракции, которую высушивали на лиофильной установке. Отогнанный этанол использовали для экстракции следующей партии сырья. Полученный сухой экстракт хранили в вакуумной упаковке в комнатных условиях без доступа света. Лиофилизат вздутоплодника сибирского проверяли на обсемененность спорами микроорганизмов и конидий грибов на агаризованной среде. Микробиологические исследования лиофилизата проводили по стандарту ТРТС 021/2011. Результаты проверки подтвердили отсутствие микробиологической обсемененности и наличие асептических условий получения биопрепарата (см. таблицу).

Проверка полученного препарата на железовосстанавливающую способность антиоксидантов соответствовала 0,13 мг эквивалента кверцетина/г препарата. Для сравнения был проведен анализ антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты, которая составила 1,25 мг эквивалента кверцетина/г. Полученные данные позволяют говорить о возможном слабом действии нового биопрепарата на оксидативный стресс, влияющий на процессы инициирования раковых клеток.

Из литературных источников, известно, что в экстракте листьев вздутоплодника сибирского, произрастающего на территории Якутии, содержится: эфирное масло 2,11 мг/г сухой массы, кумарины 56,28 мг/г сухой массы, кофеоилхинные кислоты 18,62 мг/г сухой массы, водорастворимые полисахариды 3,74, пектин 2,67, триацилглицерол 755,1 мкг/мг протеина. Компонентный состав листьев вздутоплодника сибирского включает фенилпропаноиды: 1-O-кофеоил-глюкоза, 1-O-кофеоилхиновая кислота, 6-O-кофеоил -глюкоза и 5-O-кофеоилхиновая кислота; флавоноиды: диосметин-7-O-глюкозид и хризоериол-7-O-глюкозид; хелактоны и его производные: хеллактон 4’-О-метиловый эфир, хеллактон 4’-О-ацетиловый эфир, хеллактон 3’-о-ацетил-4’-о-изобутироиловый эфир (хьюганин D), хеллактон 3′-O-изовалероил-4′-O-ацетилловый эфир (дигидросамидин), хеллактон-3'-O-глюкозид (праэрозид II); кумарины: умбеллиферон-О-дезоксигексозил-О-гексозид, умбеллиферон-7-О-(6”-апиосил)-глюкозид (6”-апиосилскиммин), пецеданол-3'-O-глюкозид [11]. Хеллактон, хеллактон 4′-O-метиловый эфир, хьюганин D, хеллактон 3'-О ацетил-4'-О-(2-метилбутироил) эфир, 6'-апиозил-скиммин, виснадин, суксдорфин и изоимператорин (см. Gantimur, D.; Syrchina, A.I.; Semenov, A.A. Isoimperatorin from Phlojodicarpus sibiricus. Chem. Nat. Comp. 1986, 22, 104-105. https://link.springer.com/article/10.1007/BF00574598; Gantimur, D.; Syrchina, A.I.; Semenov, A.A. Khellactone derivatives from Phlojodicarpus sibiricus. Chem. Nat. Comp. 1986, 22, 103-104. https://link.springer.com/article/10.1007/BF00574597; Nikonov, G.K.; Vandyshev, V.V. Visnadin-A new component of the plant genus Phlojodicarpus. Chem. Nat. Comp. 1969, 5, 101-102. https://link.springer.com/article/10.1007/BF006332902).

Наличие в экстракте листьев содержания кофеоилхинных кислот может обусловливать гипогликемическое, гипохолестеринемическое, гепатопротекторное, противоопухолевое действие на организм человека (см. Giamperi L., Bucchini A., Cara P., Fraternale D., Ricci D., Genovese S., Curini M., Epifano F. Composition and antioxidant activity of Nepeta foliosa essential oil from Sardinia (Italy) // Chemistry of Natural Compounds. - 2009. - 45. - Р. 554-556., Olthof M.R., Hollman P.C., Katan M.B. Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans // J. Nutr. - 2001. - V. 131 (1.) - P. 66-71).

Установлено, что экстракт травы вздутоплодника сибирского оказывает цитотоксический эффект на диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, вызывая снижение экспрессии антиапоптотических членов семейства Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1, индуцируя коллапс потенциала митохондриальной мембраны, что вызывает апоптоз (см. Kim Jisu, Kim Dong, Nam Jehyun, Jeon Byeol, Okhlopkova Zhanna, Zulfugarov Ismayil, Kim Sang-Woo. Anti-lymphoma Activities of Phlojodicarpus sibiricus and Artemisia kruhsiana Besser Extracts. Journal of Life Science 2020 Vol. 30. No. 4. 379~385). В настоящее время особое внимание исследователей уделяется эфирам хеллактона с их высокой эффективностью в качестве антиадипогенных средств, установлено, что дигидропиранокумарины группы хеллактонов, могут оказывать ингибирующее действие на адипогенез (см. Nugara, R.N.; Inafuku, M.; Takara, K.; Iwasaki, H.; Oku, H. Pteryxin: A coumarin in Peucedanum japonicum Thunb leaves exerts antiobesity activity through modulation of adipogenic gene network. Nutrition 2014, 30, 1177-1184. https://doi.org/10.1016/j.nut.2014.01.015). Данный аспект очень важен в силу того, что растительные компоненты, содержащиеся в экстрактах вздутоплодника сибирского, могут влиять на процессы подготовки и распространения клеток из первичного очага при лимфогематогенном метастазировании.

Заявленное техническое решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре 1 показана схема реакции превращения МТТ в формазан, на фигуре 2 - цитотоксического эффекта различных концентраций вздутоплодника сибирского, на фигуре 3 - цитотоксического эффекта различных концентраций вздутоплодника сибирского по сравнению с контролем и доксорубицином, на фигуре 4 - цитотоксического эффекта различных концентраций вздутоплодника сибирского по сравнению с контролем и доксорубицином.

Способ получения биопрепарата реализуется следующим образом.

В качестве сырья использовали надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), собранную в период цветения, при этом листья, стебли и цветки предварительно высушивали и измельчали до размеров частиц, например, 1-2 мм, известными способами.

Подготовленное сырье направляли на экстракцию водным раствором этанола, для чего, использовали 70 и 90% растворы этанола. При этом в целях получения максимального содержания экстракта и антибактериальной обработки применяли схему поочередной экстракции, состоящей из пяти этапов: начинали с 70% раствором этанола, далее повторно 90% раствором этанола, после чего, снова 70% раствором этанола, затем 90% раствором этанола и в завершении 70% раствором этанола. Таким образом, экстракция биосырья включает поочередную трехкратную экстракцию 70% раствором этанола и двукратную экстракцию 90% раствором этанола.

Каждый этап экстракции проводили при соотношении сырье-экстрагент 1:10 при температуре 23-25°C в течение 22-24 часов. При этом отгон от водно-этанольной экстракции повторно использовали для экстрагирования растительного сырья.

Полученные этанольные экстракты объединяли и упаривали в испарителе при температуре 50±2°С до получения водной фракции. Водный концентрат подвергали лиофильному высушиванию на лиофилизаторе до полного удаления растворителя и получения сухого остатка. Сухой экстракт хранили в холодильнике в герметичных пакетах.

Разработанный способ получения биопрепарата из вздутоплодника сибирского для лечения онкологических заболеваний может способствовать уменьшению степени метастазирования при лимфогематогенном пути распространения и улучшить отдаленные результаты лечения и по сравнению с известными решениями имеет следующие основные преимущества:

- наличие возможности использования возобновляемого, экологически чистого и экономически выгодного сырья для получения биопрепарата, а именно, надземную биомассу вздутоплодника сибирского, в том числе с плантационным методом выращивания растения в условиях резкоконтинентального климата на территории криолитозоны Якутии;

- препарат, содержащий биологически активные вещества растительного происхождения, обладает противоопухолевой активностью и является асептическим сухим экстрактом длительного хранения одного вида растения, готовый к употреблению и легко смешиваемый при капсулировании/таблетировании.

Эффект изобретения достигается тем, что внесение препарата в концентрациях от 0,025 г/мл (1:4) (0,027 (0,022; 0,032)) до 0,017 г/мл (1:6) (0,028(0,026; 0,037)) обеспечивает снижение жизнеспособности и гибели раковых клеток (см. фиг. 4).

Предлагаемый препарат для снижения пролиферативной активности и количества раковых клеток характеризуется следующим перечнем качеств:

• используется натуральное сырье, обладающее комплексом биологически активных свойств и не подвергшееся химической обработке;

• обладает антиоксидантной активностью, что может приводить к снижению уровня оксидативного стресса в организме;

• в исследованных дозах дает одинаковый эффект с препаратом доксорубицином;

• технологическая подготовка компонента препарата традиционная для биофармацевтики;

• сухой экстракт вздутоплодника сибирского удобен в биотехнологии, хорошо хранится и легко транспортируется.

Биопрепарат может быть использован следующим образом.

Вариант 1. Использование вздутоплодника сибирского в качестве биопрепарата с противоопухолевой активностью в дозе 0,02 г/мл (1:5), при использовании которого наблюдалось снижение количества раковых клеток HepG2 относительно контрольных значений на 52,6% и достигало одинаковых показателей цитотоксичности относительно применения препарата доксорубицина.

Вариант 2. Использование препарата в дозе 0,01 г/мл (1:10), при использовании которого наблюдалось снижение количества раковых клеток HepG2 относительно контрольных значений на 47,4%, что может найти применение в терапевтических целях.

При этом условия культивирования раковых клеток в контрольной группе и опытных групп были одинаковыми и использовались без добавления водных растворов препарата.

Результаты цитотоксичности обрабатывали на программе SPSS. Результаты статистической обработки представлены в виде: Ме (медиана) (25 и 75 процентиль), т.е. Ме (25;75).

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что препарат растительного происхождения (лиофилизированный экстракт надземной части дикорастущего растения - вздутоплодника сибирского) способствует снижению пролиферации раковых клеток и снижению их выживаемости. Антиоксидантная активность компонентов биопрепарата может влиять на оксидативный стресс в организме.

Результаты лабораторных испытаний

Тип исследования. Исследования проводили в стерильных условиях in vitro, а эффективность препарата проверяли на клетках линий HepG2. HepG2 - клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека, данная линия клеток получена из карциномы печени 15-летнего мужчины (см. Nature, 1979, 282, 615; Science, 1980, 209, 497).

Методика исследования. Измерение противоопухолевой активности основано на методе МТТ. МТТ - тест является индикатором функции митохондрий в жизнеспособных клетках, основанная на восстановлении тетразолия.

Для постановки данного теста проводили культивирование раковых клеток HepG2 при 37°С с содержанием в атмосфере 5% СО₂ в среде DMEM с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки до образования монослоя. Для получения клеточной суспензии образовавшийся монослой клеток трипсинизировали с последующей инактивацией трипсина с добавлением питательной среды.

Для осуществления теста использовали 96-луночный планшет. В каждую лунку вносили от 2500 до 2800 клеток в 200 мкл культуральной среды. Далее планшеты с клетками инкубировали 24 часа в СО₂ инкубаторе для адгезии клеток при температуре 37°С. После пролиферации и адгезии клеток HepG2 добавляли заранее приготовленную суспензию лиофилизата вздутоплодника сибирского по 22 мкл на каждую лунку, кроме контрольных лунок. После внесения исследуемого вещества клетки инкубировали в СО₂ инкубаторе в стандартных условиях в течении 72 часов. По истечении указанного времени удаляли культуральную среду с исследуемыми веществами с помощью вакуумного аспиратора.

Отдельно в ванночке для многоканального дозатора готовили раствор из 9 мл культуральной среды + 1 мл МТТ - реагента (5 мг/мл в растворе Хэнкса) для одного 96-луночного культурального планшета. Приготовленный раствор вносили в каждую лунку планшета по 100 мкл и инкубировали в СО₂ инкубаторе в течение 3,5 часов. По истечении времени инкубации питательную среду с исследуемыми веществами с помощью аспиратора удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл ДМСО, после этого повторно инкубировали в течение 10 мин. После последней инкубации в лунках появляется фиолетовое окрашивание. Детекцию фиолетового окрашивания проводили на планшетном ридере (Bio-Rad iMark) при 650 нм длине волны.

Приготовление МТТ раствора. Выбор методики обусловлен тем, что МТТ имеет положительный заряд и легко проникает в живые эукариотические клетки. (3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-ифенилтетразолиум бромид) - МТТ реагент под действием митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток превращается в нерастворимый в воде формазан, имеющий фиолетовую окраску (см. фиг. 1).

При лизисе клеток кристаллы, сформированные в живых клетках, легко переходят в раствор ДМСО (диметилсульфоксид). По оптической плотности раствора формазана определяли активность митохондриальных дегидрогеназ и, соответственно, жизнеспособность клеток.

Полученные данные оптической плотности в исследуемых лунках вносили в базу данных, которые далее были обработаны пакетом программ IBM SPSS Statistic 23.

В качестве образца лекарственного препарата с доказанной противоопухолевой активностью был выбран Доксорубицин. Доксорубицин, описанный в патенте US №3590028, обладает широким диапазоном применения при лечении раковых заболеваний и используется при лечении лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Он подавляет синтез ДНК и РНК: интеркалирует в двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований (нарушается матрица и изменяется пространственная структура) и вызывает расщепление ДНК вследствие образования свободных радикалов. Помимо этого, противоопухолевое действие возможно обусловлено изменением клеточных функций в результате связывания с липидами клеточных мембран и взаимодействием с топоизомеразой II.

Полученный лиофилизат сравнивали с лекарственным препаратом Доксорубицин.

Результаты исследования. На начальном этапе исследования были проведены эксперименты с различными концентрациями исследуемого вещества - суспензии лиофилизата вздутоплодника сибирского: 0,01 г/мл (1:10); 0,001 г/мл (1:100); 0,0001 г/мл (1:1000) и 0,00001 г/мл (1:10000), исходя из исходной концентрации 0,1 г/мл (1:1). При сравнительном анализе выявлено статистически значимые различия, свидетельствующие о наиболее эффективной цитотоксичности по отношению к раковым клеткам HepG2 концентрации 0,01 г/мл (1:10) по сравнению с другими меньшими концентрациями (см. фиг. 2) и контрольной группой (р=0,000). Каждая концентрация была представлена в 16 лунках планшета.

На втором этапе исследования кроме контрольной группы (только раковые клетки без добавления вздутоплодника сибирского) в экспериментальные группы добавили группу с лекарственным препаратом Доксорубицин. Концентрацию таблетированной формы лекарственного препарата доводили до 0,5 мг/мл. С учетом предыдущих полученных результатов, указывающих на выраженную степень цитотоксичности концентрации 0,05 г/мл (1:10) на данном этапе были определены более высокие концентрации вздутоплодника сибирского: 0,02 г/мл (1:5), 0,01 г/мл (1:10) и 0,006 г/мл (1:15). Каждая группа сравнения имела по 16 лунок. Результаты статистического анализа указывают на то, что выраженный цитотоксический эффект имеет концентрация вздутоплодника сибирского 0,02 г/мл (1:5), которая оказалась близким к показателям лекарственного препарата (см. фиг. 3). Сравнительный анализ не выявил статистически значимых различий оптической плотности между значениями суспензии с вздутоплодником сибирского с концентрацией 0,02 г/мл (1:5) (0,008(0,005;0,012)) и доксорубицином (0,007 (0,003; 0,0107)). По сравнению с контролем статистически значимые различия оптических плотностей имеют значение лекарства и концентрации 0,02 г/мл (1:5) и 0,01 г/мл (1:10) вздутоплодника сибирского.

На третьем этапе исследования были рассмотрены следующие концентрации вздутоплодника сибирского: 0,08 г/мл (1:1,25); 0,025 г/мл (1:4); 0,017 г/мл (1:6) и 0,014 г/мл (1:7,5) по сравнению с лекарственным препаратом и контролем (см. фиг. 4). Результаты свидетельствуют, что более эффективная концентрация вздутоплодника сибирского находится в диапазоне 0,025 г/мл (1:4) (0,027 (0,022; 0,032)) до 0,017 г/мл (1:6) (0,028(0,026; 0,037)), медианы которых максимально близки к значению цитотоксичности лекарственного препарата (0,025 (0,020; 0,036)).

Таким образом, проведенное экспериментальное исследование указывает на противоопухолевую активность в отношении культивированных раковых клеток HepG2 суспензии лиофилизата вздутоплодника сибирского с наиболее эффективной ее концентрацией 0,025 г/мл (1:4) до 0,017 г/мл (1:6).

Таблица. Результаты микробиологического исследования лиофилизата вздутоплодника сибирского, выполненного по стандарту ТРТС 021/2011

№ Исследуемые показатели Допустимые уровни Результат 1 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), КОЕ/г, не более 5*10⁵ Не обнаружено 2 Бактерии группы кишечных палочек (колиформы), не допускается в массе продукта, (г) 0,01 Не обнаружено 3 E. Coli, не допускается в массе продукта, (г) 0,1 Не обнаружено 4 S. aureus, не допускается в массе продукта, (г) 1,0 Не обнаружено 5 Плесени КОЕ/г, не более 10³ Не обнаружено 6 Дрожжи КОЕ/г, не более 100 Не обнаружено

Изобретение относится к области биохимии и фармацевтической промышленности, а именно к способу получения препарата на основе биологически активных веществ сухого раствора вздутоплодника сибирского (лат. Phlojodicarpus sibiricus), обладающего противоопухолевым эффектом. Способ получения экстракта надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), характеризующийся тем, что в качестве сырья используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), собранную в период цветения, для чего предварительно высушенное и измельченное сырье при соотношении сырье-экстрагент 1:10 поочередной последовательностью экстрагируют трехкратно 70% водным раствором этанола и двукратно 90% водным раствором этанола при температуре 23-25°С в течение 22-24 часов на каждом этапе, полученные этанольные экстракты объединяют и упаривают в испарителе до получения водной фракции, которую подвергают лиофильному высушиванию до получения сухого экстракта. Применение экстракта надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), полученного способом по п. 1, в качестве биопрепарата, обладающего противоопухолевым действием. Вышеописанный способ позволяет получить экстракт путем использования надземной части биомассы вздутоплодника сибирского, что не представляет угрозы сокращения популяции многолетнего растения, полученный экстракт расширяет ассортимент биопрепаратов, обладающих противоопухолевой активностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Способ получения экстракта надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), характеризующийся тем, что в качестве сырья используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), собранную в период цветения, для чего предварительно высушенное и измельченное сырье при соотношении сырье-экстрагент 1:10 поочередной последовательностью экстрагируют трехкратно 70% водным раствором этанола и двукратно 90% водным раствором этанола при температуре 23-25°С в течение 22-24 часов на каждом этапе, полученные этанольные экстракты объединяют и упаривают в испарителе до получения водной фракции, которую подвергают лиофильному высушиванию до получения сухого экстракта.

2. Способ получения экстракта по п. 1, отличающийся тем, что для экстрагирования растительного сырья повторно используют отгон от водно-этанольной экстракции.

3. Применение экстракта надземной биомассы вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), полученного способом по п. 1, в качестве биопрепарата, обладающего противоопухолевым действием.