СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы беременной женщины.

Актуальность предлагаемого способа оценки состояния иммунной системы беременной женщины определяется высокой частотой встречаемости таких осложнений беременности, как невынашивание и поздние ОПГ-гестозы, где в патогенезе одну из ведущих ролей играют иммунологические механизмы.

Известен способ определения иммуномодулирующей активности нейтрофилов, заключающийся в культивировании клеток в питательной среде в присутствии активатора и без него с добавлением индикатора pH среды, выделения супернатантов нейтрофилов и определения в них фотометрически индекса экстинции. Показатели ниже пороговой величины (1,41 - 1,43) определяют стимулирующую активность нейтрофилов, а показатели выше пороговой величины - супрессорную активность нейтрофилов.

Однако данный способ имеет ряд недостатков:
не ясен структурный состав супернатанта нейтрофилов;
показатель зависит от многих технических условий;
способ требует специальной аппаратуры для культивирования клеток и выделения супернатантов;
маленький размах пороговой величины затрудняет точность оценки в больших выборках при массовых обследованиях;
способ требует применения нехарактеризованного активатора, активность которого может меняться даже с изменением сроков хранения;
способ требует значительных затрат рабочего времени.

Наиболее близкими по техническому решению является способ определения функционального статуса лейкоцитов по содержанию РАЛ-2 в сыворотке крови, оцениваемом методом двойной иммунодиффузии а агаре. Повышение секреции РАЛ-2 выше уровня 0,22±0,03 мг% у беременных женщин в 3 триместре гестации свидетельствует о повышенной функциональной активности нейтрофилов и об активации иммунной системы. (Авт. св. N 1716447, 1991).

Недостатками способа-прототипа является:
способ является полуколичественным, что значительно снижает точность оценки состояния лейкоцитов;
исследуемый показатель изменяется при любой соматической патологии, особенно воспалительного генеза;
отсутствует тест-система для определения РАЛ-2 промышленного изготовления, что обуславливает их нестандартизованность;
чувствительность системы для определения РАЛ-2 снижается при хранении;
определение РАЛ-2 в сыворотке крови лишь косвенно отражает функциональную активность лейкоцитов;
значительна роль субъективного фактора при постановке метода и оценке его результатов;
отсутствуют данные о точности способа.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Целью заявляемого способа является определение функциональной активности лейкоцитов для оценки состояния иммунной системы беременной женщины на поздних сроках беременности путем изучения показателя бактерицидной активности нейтрофилов периферической крови с точностью 82,61%.

Указанная цель достигается следующим образом. В периферической венозной крови женщин в сроки беременности после 20 недель гестации определяются два показателя НСТ-активности: спонтанный (НСТ) и после 30 минутной инкубации в Среде 199 при 37^oC (НСТ'). По стандартной формуле •100% вычисляют индекс активации лейкоцитов, который представляет процент изменения показателей НСТ-активности после 30 минутной инкубации в Среде 199 при 37^oC. При нулевых и отрицательных значениях индекса активации лейкоцитов функциональная активность лейкоцитов определяется как нормальная и состояние иммунной системы оценивается как соответствующее норме, характер течения беременности - без осложнений. При положительных значениях индекса активации функциональная активность лейкоцитов определяется как повышенная, состояние иммунной системы - активированное, что впоследствии ведет к развитию акушерской патологии.

Способ осуществляется следующим образом. В пробирку, содержащую 25 ед гепарина забирают 1 мл крови из локтевой вены и добавляют 1 мл Среды 199. В пробирку подслаивают поочередно по 1 мл фиколл-верографина с градиентами плотности 1,078 и 1,114. Клеточные фракции разделяют методом скоростного центрифугирования при 200 g в течение 20 мин. Полиморфоядерные лейкоциты собирают в интерфазе фиколл-верографина 1,078 - 1,114. Клеточную суспензию отмывают 2 раза Средой 199 центрифугированием при 200 g в течение 10 мин и доводят концентрацию до 2•10⁶ кл/мл. Постановка спонтанного теста на НСТ-активности нейтрофилов осуществляется стандартным методом. Для определения индекса активации клетки предварительно подвергаются инкубации в течение 30 мин при 37^oC в Среде 199, далее реакция осуществляется аналогично контрольному тесту. Показатели НСТ-активности нейтрофилов вычисляются при световом микроскопировании. Состояние лейкоцитов оценивают по разнице значений спонтанной НСТ-активности и после инкубации в Среде 199 при 37^oC в течение 30 мин.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что авторами впервые предлагается оценивать функциональную активность лейкоцитов и определить состояние иммунной системы беременной женщины по нидексу активации лейкоцитов.

Показатель НСТ-теста ранее использовался для определения бактерицидной активности нейтрофилов, как один из диагностических критериев воспалительного процесса. Однако, в подобной интерпретации данный тест используется впервые. Взаимосвязь между изменением НСТ-активности при воздействии 30 минутной инкубации клеток при 37^oC с изменением функциональной активности лейкоцитов и состоянием иммунной системы беременной женщины была обнаружена впервые. Повышение НСТ-активности лейкоцитов после 30 мин инкубации при 37^oC свидетельствует об активированном состоянии лейкоцитов, что оценивается как дисбаланс в состоянии иммунной системы, так как известно, что состояние нейтрофилов может служить индикатором направленности иммунологических процессов, ведущих к развитию акушерской патологии.

Использование предлагаемого способа позволяет выявить нарушение в состоянии иммунной системы, что дает возможность своевременно диагностировать осложнения беременности и провести лечебно-профилактические мероприятия, направленные на восстановление нарушенного иммунного гомеостаза.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что установлены значения функциональной активности лейкоцитов, характеризующие нормальное состояние (индекс активации равен или менее 0%) и активированное состояние (индекс активации более 0%) иммунной системы у беременных.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Беременная М., 22 лет, первобеременная. Данная беременность протекает без осложнений. При плановом исследовании на RW и ВИЧ инфекцию в 30 недель беременности параллельно проведены иммунологические исследования. Проведено определение индекса активации лейкоцитов по заявляемому способу. Установлено, что индекс активации составил -29%. Состояние иммунной системы беременной женщины рассматривается как без существенных изменений, так как функциональная активность лейкоцитов в пределах нормы.

При последующем наблюдении за беременной М. осложнений беременности не отмечалось. Роды произошли в срок (40 недель) и закончились рождением доношенного новорожденного с массой тела 3500 г, ростом 58 см и оценкой по шкале Апгар 8 - 9 баллов.

Пример 2. Беременная Ш., 23 лет. Настоящая беременность вторая. При обследовании в женской консультации при сроке 15 - 16 недель выявлены признаки угрозы прерывания беременности, по поводу чего проходила стационарное лечение в ОПБ Ивановского НИИ материнства и детства. Беременная Ш. выписана в 18 недель с диагнозом: беременность 18 недель, прогрессирующая. При последующем наблюдении в женской консультации беременность протекала без осложнений. При плановом обследовании в 30 недель проведено определение индекса активации лейкоцитов по заявляемому способу. Индекс активации лейкоцитов составил 0%. Функциональная активность лейкоцитов оценена как в пределах нормы, а состояние иммунной системы - без существенных изменений.

При последующем наблюдении за беременной Ш. осложнений в течение беременности не было. Беременность закончилась своевременными родами в срок 39 недель и рождением доношенного новорожденного с массой тела 3400 г и длиной 55 см, с оценкой по шкале Апгар 8 - 9 баллов.

Пример 3. Беременная А., 27 лет. Настоящая беременность третья. Первая беременность закончилась своевременными родами в срок 39 недель рождением доношенного новорожденного с массой тела 3200 г, ростом 51 см и оценкой по шкале Апгар 7 - 8 баллов. Вторая беременность - медицинский аборт в сроке 8 недель, без осложнений. Настоящая беременность протекает без осложнений. При иммунологическом обследовании в 30 недель показатель функциональной активности лейкоцитов (индекс активации лейкоцитов) составил 118%, что расценено как признак повышения функциональной активности лейкоцитов и активации иммунной системы. Такое поведение функциональной активности лейкоцитов является неблагоприятным для дальнейшего течения беременности.

При дальнейшем наблюдении за беременной А. в сроке 35 недель выявлено наличие патологической прибавки массы тела - 400 г за 1 неделю, видимые отеки отсутствовали. Рекомендованное ограничение потребления жидкости до 1 л/сут, разгрузочная диета. В сроке 37 недель у беременной А. объективно: АД - 130/90, отеки нижних конечностей, белок в моче 0,099 г/л. Беременная А. помещена в стационар с диагнозом нефропатия I. Проведено общепринятое лечение. Беременность закончилась родами в срок 40 недель и рождением доношенного новорожденного с массой тела 2800 г, ростом 54 см и оценкой по шкале Апгар 7 - 8 баллов.

Преимуществами заявляемого способа являются:
простота, общедоступность проведения методики и вычисления индекса активации;
способ не требует специальной явки женщины в женскую консультацию, так как проводится в декретируемые сроки явки для обследования на RW и ВИЧ инфекцию;
малое количество (1 мл) крови, необходимый для исследования;
не требуется специальное оборудование и дорогостоящие реактивы;
высокая точность (82,61%) способа определения состояния активации иммунной системы у беременной женщины.

Проведено обследование 46 беременных женщин в поздние сроки гестации по заявляемому способу. Из них у 22 женщин показатель индекса активации лейкоцитов был меньшим или равным 0%, у 24 женщин показатель индекса активации был большим 0%. Впоследствии у 18 женщин из 24, имевших повышенную функциональную активность лейкоцитов, беременность осложнилась развитием позднего ОПГ-гестоза, у 20 женщин из 22, имевших функциональную активность лейкоцитов в пределах нормы, беременность в дальнейшем протекала без осложнений. Данные представлены в таблице.

Таким образом точность, чувствительность и специфичность заявляемого способа составили, %:
точность - 82,61
чувствительность - 75,00
специфичность - 90,90%.

Использование: в области медицины, а именно в акушерстве для оценки состояния иммунной системы беременной женщины. Сущность изобретения: в периферической венозной крови беременных женщин в 3 триместре гестации определяют индекс активации лейкоцитов по разнице показателей НСТ-теста спонтанного и после 30 минутной инкубации в среде 199 при 37^oC. Технический результат: с точностью 82,61% определяется функциональная активность лейкоцитов при беременности. 1 табл.

Способ определения функциональной активности лейкоцитов при беременности путем исследования периферической крови беременной женщины в 3 триместре гестации, отличающийся тем, что определяют показатели НТС-активности: спонтанный (НСТ) и после 30-минутной инкубации в среде 199 при 37^oС (НСТ'), рассчитывают индекс активации лейкоцитов по формуле и при нулевых и отрицательных значениях индекса активации функциональная активность лейкоцитов считается нормальной, а при положительных значениях индекса активации функциональная активность лейкоцитов определяется как повышенная.