СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к микробиологии, в частности, к способу получения моноспецифических сывороток антимелитензис и антиабортус для дифференциации по антигенной структуре штаммов бруцелл.

Изобретением решается задача повышения чувствительности сывороток при проведении реакции агглютинации, что обеспечивает расширение возможностей эпизоотологоэпидемического надзора по бруцеллезу, диагностике и лечению данной инфекции.

Известна принципиальная схема получения моноспецифических сывороток (Методические указания по лабораторной диагностике бруцеллеза у людей и выделению возбудителя из пищевых продуктов и других материалов.- Ставрополь, 1962. - С. 21). Моноспецифические сыворотки получают путем иммунизации кроликов эталонными штаммами бруцелл с последующей абсорбцией сыворотки бактериальной массой (бакмассой) эталонного штамма гетерологичного вида бруцелл. Реакцию агглютинации ставят обычным объемным методом до титра сыворотки, начиная с разведения 1:10. В качестве антигена при постановке реакции агглютинации применяют 3-суточную агаровую культуру живых бруцелл изучаемого штамма, разведенную до 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл физиологического раствора. Для разведения сыворотки применяют физиологический раствор с 0,5% карболовой кислоты.

Недостатком методики является низкая чувствительность сыворотки при разведении более чем 1:160, что препятствует получению результатов с достаточной степенью достоверности.

Наиболее близким по существу к заявляемому изобретению является способ получения моноспецифических сывороток с использованием штаммов бруцелл видов метилензис и абортус 1-х биоваров (Corbel M.J., Yill K.P.W and Thomas E.L. Methods for the Identification of Brucella. Ministry of Agriculture, Flaheries and Food, Research Seetion. Central Veterinary Lab. New Haw, Weybrige, Sury KT153 N 13, 1978).

Способ осуществляется следующим образом. Проводят иммунизацию кроликов внутривенно разовыми дозами по 0,5 мл суспензией штаммов или мелитензис 16 М или бруцелла абортус 544, в зависимости от того, какую из сывороток надо получить, в дозе, содержащей 10⁹ КОЕ в 1 мл. Через 5-7 дней животных обескровливают при титре сывороточной агглютинации не менее 1:1280 против гомологичного антигена. Затем путем смешивания проводят абсорбцию сыворотки бакмассой штамма гетерологичного вида бруцелл из расчета 1 мл культуры с концентрацией 10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки. Иными словами, если получаем сыворотку антимелитензис, то заражаем кроликов штаммом бруцелла мелитензис, а абсорбцию ведем штаммом бруцелла абортус. Если получаем сыворотку антиабортус, то заражаем животных штаммом бруцелла абортус, а абсорбцию ведем штаммом бруцелла мелитензис. Затем сыворотку инкубируют при 37^oC в течение 2 ч, восстанавливают центрифугированием, разводят в фенолсолевом растворе, фасуют и хранят при 4^oC.

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие сходные существенные признаки.

Иммунизация кроликов разовой дозой штаммами бруцелла мелитензис и абортус 1 биовара, обескровливание животных через 5-7 дней, абсорбция сыворотки бакмассой штамма гетерологичного вида (абортус или мелитензис) с последующей ее инкубацией при 37^oC в течение 2 ч, центрифугирование, разведение в растворе фенола и фасовкой, обеспечивающие получение моноспецифических сывороток для дифференцирования штаммов бруцелл.

Недостатком прототипа является небольшая чувствительность получаемой сыворотки, так как максимальное разведение в реакции агглютинации достигает титра 1:160. Указанный недостаток обусловлен тем, что используемый в прототипе штамм бруцелла мелитензис 16М склонен к диссоциативным процессам, что в свою очередь приводит к снижению его антигенной активности и как следствие снижению титра получаемой сыворотки.

Целью изобретения является повышение чувствительности моноспецифической сыворотки антиабортус и антимелитензис для дифференциации возбудителей бруцеллеза.

Для достижения поставленной цели предлагаемый способ получения моноспецифических сывороток антимелитензис и антиабортус включает иммунизацию кроликов разовой дозой гетерологичного штамма бруцелл в каждом отдельном случае, для штамма бруцелла мелитензис иммунизирующая доза 2,8-3,0•10⁸ КОЕ/мл, а для штамма бруцелла абортус 544 - 1,8-2,0•10⁸ КОЕ/мл, обескровливание животных через 5-7 дней, инактивацию сывороток при 60-65^oC в течение 1-1,5 ч, подготовку бакмассы гетерологичных видов бруцелл для абсорбции сывороток путем выращивания штаммов бруцелл в течение 70-72 ч, центрифугирование, охлаждение осадка в течение 24-26 ч и добавление к осадкам физиологического раствора, абсорбцию сывороток гетерологичным видом бруцелл (абортус или мелитензис) из расчета 3,5-3,7•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, с последующей инкубацией сывороток при 37^oC в течение 2 ч, восстановлением сывороток путем центрифугирования, разведением в растворе фенола и фасовкой.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки.

Использование в качестве иммунизирующего агента в одном случае и как абсорбента в другом, штамма вида бруцелла мелитензис 28. Штамм бруцелла мелитензис 28 зарегистрирован в коллекционном центре Ставропольского научно-исследовательского противочумного института за N 28. По сравнению со штаммов бруцелла мелитензис 16М, при применении которого получаем титры моноспецифических сывороток 1:160, предлагаемый штамм при его использовании в производстве моноспецифических сывороток антиабортус и антимелитензис дает возможность получить титры не менее 1:320-1:640, так как он не склонен к диссоциативному процессу в отличие от штамма бруцелла мелитензис 16М и обеспечивает высокую концентрацию антител, достаточную для повышения чувствительности сывороток в реакции агглютинации.

Уменьшение концентрации заражающей дозы при иммунизации кроликов для бруцелла мелитензис 28 и для бруцелла абортус 544 до 2,8-3,0•10⁸ КОЕ/мл и 1,8-2,0•10⁸ КОЕ/мл соответственно оказывает стимулирующее действие на синтез антител. Получение сывороток, отвечающих необходимым требованиям, во многом зависит от схемы иммунизации, кратности, последовательности, сроков и способов введения определенных доз антигена. Дозы антигена, оказывающие наиболее интенсивное стимулирующее влияние на синтез антител, как правило, небольшие. В экспериментах доказано, что предлагаемые дозы оптимальны, так как именно такие дозы индуцируют выработку высокоавидных антител, способных прочно связывать антиген. Способы введения антигена могут быть различными. Наиболее высокие титры антител удается получить при внутривенном способе введения антигена, так как в иммунный ответ включается селезенка, где находится большое количество антителобразующих клеток, поэтому мы пользуемся этим способом введения и используем предлагаемые дозы заражения при иммунизации.

Инактивация сывороток при 60-65^oC в течение 1-1,5 ч с добавлением мертиолята натрия до концентрации 1:10000 обеспечивает большую степень обеззараживания. При проведении серологических исследований проводят предварительное обеззараживание материала - сыворотки крови обеззараживают добавлением мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием их при 56^oC в течение 30 мин (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности. Санитарные правила СП 1.2.011-94. Госкомсанэпиднадзор России.- М.- 1994. - C. 17). В эксперименте увеличение времени инактивации до 1,5 ч дает большую степень безопасности при работе персонала с бруцеллезной сывороткой. Подготовка бакмассы бруцелл для абсорбции с сывороткой путем выращивания культур в течение 70-72 ч, центрифугирования, охлаждения осадка в течение 24-26 ч и добавления к осадку физиологического раствора, обеспечивает более высокую по сравнению с прототипом степень абсорбции и чувствительность сывороток в реакции агглютинации, что характеризуется конечным титром сывороток не менее чем 1:320-1:640.

Увеличение количества бакмассы для абсорбции сывороток до 3,5-3,7•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки дает возможность повысить чувствительность сывороток за счет более интенсивного блокирования перекрестных антител.

Таким образом, между отличительными признаками и целью изобретения существует причинно-следственная связь. Возможность практического осуществления заявляемого способа с использованием полной совокупности общих и отличительных признаков подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Кроликам массой 2,5-3,0 кг вводят внутривенно 2-суточную культуру бруцелл в количестве 1 мл с концентрацией для штамма бруцелла мелитензис 28 3,0•10⁸ КОЕ/мл, а для штамма бруцелла абортус 2,0•10⁸ КОЕ/мл. Через 5-7 дней животных обескровливают, сыворотку отсасывают и инактивируют при 60^oC в течение 1 ч. Параллельно выращивают культуру гетерологичного вида бруцелл для проведения абсорбции в первом случае штаммом бруцелла абортус 544, во втором - штаммом бруцелла мелитензис 28 на матрацах в течение 72 ч. Затем бакмассу смывают, центрифугируют, осадок охлаждают в течение 24 ч и добавляют к нему физиологический раствор в таком количестве, чтобы конечная концентрация бакмассы составила 3,7 •10⁹ КОЕ/мл. Полученную бакмассу в количестве 3,7•10⁹ КОЕ/мл добавляют к 10 мл сыворотки, инкубируют при 37^oC в течение 2 ч и центрифугируют. В сыворотку добавляют 0,25-0,5% фенола и перемешивают. Сыворотки готовы. При титровании полученных сывороток с добавлением бруцеллезного диагностикума реакция прошла на (++++) при максимальном разведении 1:640.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что при иммунизации кроликов используют концентрацию бруцелла мелитензис 28 в 2,8•10⁸ КОЕ/мл, а бруцелла абортус 544 в 1,8•10⁸ КОЕ/мл вводимой суспензии антигена. Инактивацию сыворотки проводят при 62^oC в течение 1,2 ч, бакмассу выращивают в течение 70 ч, охлаждение осадка бакмассы проводят 25 ч, при перекрестной абсорбции используют концентрацию клеток штаммов бруцелла мелитензис 28 и бруцелла абортус 544 в 3,5•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки. Наибольшая степень разведения при положительной реакции сыворотки составляет 1: 320.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что при иммунизации кроликов применяют концентрацию штаммов бруцелла мелитензис 28 в 2,9•10⁸ КОЕ/мл, а бруцелла абортус 544 в 1,9•10⁸ КОЕ/мл вводимой суспензии антигена. Инактивацию сывороток проводят при 65^oC в течение 1,5 ч, бакмассу выращивают в течение 71 ч, охлаждение осадка бакмассы проводят 26 ч, а при перекрестной абсорбции используют концентрацию клеток штаммов бруцелла мелитензис 28 и бруцелла абортус 544 в 3,6•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки. При титровании полученных сывороток получаем их максимальное разведение, равное 1: 640.

Выбор граничных значений заявляемых параметров предлагаемого способа обусловлен тем, что уменьшение концентраций иммунизирующего агента-штамма бруцелла мелитензис 28 ниже 2,8•10⁸ КОЕ/мл или штамма бруцелла абортус 544 ниже 1,8•10⁸ КОЕ/мл вводимой суспензии приводит к недостаточному образованию антител, что в конечном итоге снижает чувствительность получаемой сыворотки, а увеличение иммунизирующих доз выше 3,0•10⁸ КОЕ/мл для штамма бруцелла мелитензис 28 и для штамма бруцелла абортус 544 выше 2,0•10⁸ КОЕ/мл вводимой суспензии нецелесообразно, так как заявленные пределы концентраций используемых штаммов обеспечивают достаточную степень иммунизации животных, в противном случае дальнейшее повышение иммунизирующих доз приведет к недифференцированному иммунологическому ответу.

Заявленные пределы по времени и температуре инактивации сыворотки, а также по времени выращивания и охлаждения бакмассы необходимы и достаточны для обеззараживания сыворотки и созревания бакмассы для перекрестной абсорбции.

Уменьшение концентрации бакмассы для перекрестной абсорбции сывороток ниже 3,5•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки приводит к снижению степени абсорбции и как следствие чувствительности ее. А при увеличении количества бакмассы при перекрестной абсорбции выше, чем 3,7•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, возникает опасность получения неспецифических реакций.

Таким образом, изобретение реально осуществимо, его использование позволяет организовать получение моноспецифических сывороток, чувствительность которых в 2-4 раза выше, чем сывороток, получаемых по способу-прототипу.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциации возбудителей бруцеллеза. Повышение чувствительности в 2-4 раза моноспецифических сывороток антиабортус в первом случае и антимелитензис во втором достигается путем внутривенной иммунизации кроликов разовой дозой штамма бруцелла абортус 544 (1,8-2,0•10⁸ колониеобразующих единиц - КОЕ в 1 мл физиологического раствора) в первом случае и разовой дозой штамма бруцелла мелитензис 28 (2,8-3,0•10⁸ КОЕ в 1 мл физиологического раствора) во втором случае, обескровливания животных через 5-7 дней, инактивации сыворотки при 60-65^oC в течение 1-1,5 ч и перекрестной абсорбцией сыворотки бакмассой штамма бруцелла мелитензис 28 в первом случае, а во втором случае бакмассой штамма бруцелла абортус 544, выращенной в течение 70-72 ч, центрифугированной, охлажденной в течение 24-26 ч и разбавленной физиологическим раствором, при концентрации абсорбирующей бакмассы в 3,5-3,7•10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки с последующим добавлением к готовой сыворотке раствора фенола и фасовкой.

Способ получения моноспецифических сывороток для диффеpенциации возбудителей бруцеллеза, включающий иммунизацию кроликов штаммами бруцелл видов мелитензис и абортус 544 разовой дозой внутривенно, обескровливание животных через 5 7 дней, перекрестную абсорбцию сыворотки бактериальной массой гетерологичного вида бруцелл с последующей ее инкубацией при 37^oС в течение 2 ч, восстановление сыворотки путем центрифугирования, разведением в растворе фенола и фасовкой, отличающийся тем, что при иммунизации кроликов в качестве иммунизирующего агента используют новый штамм бруцелла мелитензис 28, при этом его заражающая доза составляет 2,8 3,0 • 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл физиологического раствора, а при заражении бруцелла абортус 544 доза заражения составляет 1,8 2,0 • 10⁸ КОЕ на 1 мл суспензии, после обескровливания животных сыворотку инактивируют при 60 65^oС в течение 1 1,5 ч, бактериальную массу бруцелл гетерологичного штамма для абсорбции готовят путем выращивания культур в течение 70 72 ч, центрифугирования, охлаждения осадка в течение 24 26 ч и добавления к осадку физиологического раствора, при перекрестной абсорбции сыворотки бактериальной массой гетерологичного вида бруцелл ее используют в количестве 3,5 3,7 • 10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки.