СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К БРУЦЕЛЛАМ В R-ФОРМЕ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/40 A61K39/10 G01N33/569 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве диагностической сыворотки к бруцеллам в R-форме.

Известно использование в качестве штамма-продуцента для получения R-антигенов штаммов типа B. ovis (Патент РФ N 2051963, C 12 N 1/20, A 61 K 39/10; 10.01.96. Бюл. N 1).

Однако получение гомогената R-антигена из этих штаммов в силу их био-физиологических признаков требует особых условий. B.ovis растет в присутствии повышенного содержания CO₂ при температуре роста 20-40^oC и pH 6,6-7,4. Кроме того, наличие в популяциях клеток в S-форме требует многократной очистки бактериальной культуры.

Наиболее близким по существу и назначению к заявляемому является способ получения антисыворотки, реагирующей только с шероховатыми формами штаммов бруцелл (Corbel n.j., Gill K.P.W.and Thomas E.L./Methods for the Identification of Brucella//New Haw, Weybridge, Gurrey FT 15 3NB, 1978). Согласно этому способу для получения R-антигена используют штамм B.ovis 63/290. Культуру антигена выращивают на плотном питательном агаре с инкубацией при 37^oC в присутствии CO₂ в течение 4 дней, затем культуру клеток проверяют на чистоту, ресуспендируют, засевают на матрацы для выращивания, снова инкубируют в течение 4-х дней при 37^oC и вновь проверяют на чистоту. Суспензию процеживают через 2 слоя марли и центрифугируют при 3000g в течение 20 минут. Удаляют супернатант и дважды промывают бруцеллы путем центрифугирования, подогревают их при 80^oC в течение 2 часов, центрифугируют бактерии при 3000g в течение 30 минут, собирают надосадочную жидкость и центрифугируют при 60000g в течение 6 часов, удаляют надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 20-ти кратном объеме 0,15 моль/л NaCl, замораживают и затем оттаивают. Полученную суспензию гомогенизируют с адъювантом Фрейнда. Гомогенизатом иммунизируют кроликов подкожно в 4 разных участках левой задней части, через 7 дней производят повторную инъекцию гомогенизата подкожно в правую заднюю часть кролика. Через 4 недели кроликов обескровливают, отделяют сыворотку, абсорбируют ее антигеном B.ovis 63/290. Сыворотку титруют против гладких форм антигена B.abortus. Удаляют гладкие формы агглютининов, абсорбируя сыворотку с гладкими формами B.abortus и восстанавливают центрифугированием. Каждую партию сыворотки испытывают на наличие агглютининов к шероховатым и гладким формам бруцелл. Удовлетворительные пробы сыворотки агглютинируют шероховатые формы до высоких титров и не дают реакции агглютинации с гладкими формами бруцелл даже в низких разведениях.

Недостатком прототипа является сложность и длительность процесса, обусловленные био-физиологическими особенностями штамма B.ovis 63/290, требующими особых условий выращивания. Необходимость в процессе производства сыворотки фильтрации живой культуры через марлю, многократного центрифугирования живой культуры, что создает экологически опасные условия производства сыворотки.

Целью изобретения является осуществление возможности экологически безопасного производства сыворотки к бруцеллам в R-форме за счет упрощения процесса и исключения операции фильтрации, сокращения этапов центрифугирования и повышения интенсивности генерирования антител в процессе иммунизации.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения диагностической сыворотки к бруцеллам в R-форме включает выращивание культуры R-антигена из субкультур штаммов B.abortus, стабильно сохраняющих R-форму, путем инкубирования их на плотном питательном агаре и на матрацах при 37^oC в обычных условиях, контроль культуры на чистоту, подготовку взвеси живой культуры бруцелл на физиологическом растворе для инъекции с последующей двукратной иммунизацией кроликов полученной взвесью антигена внутривенно частями дискретно по времени, обескровливанием их через 1 месяц после последней инъекции, абсорбцию сыворотки бактериальной массой бруцелл в S-форме и ее контроль на наличие агглютинации к шероховатым формам бруцелл.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Использование в качестве штамма-продуцента для получения R-антигена субкультуры штаммов B.abortus, стабильно сохраняющих R-форму, обеспечивает упрощение технологии получения R сыворотки, т.к. биологические свойства выращивания B.abortus не требуют особых условий и отсутствие S-форм в получаемых субкультурах не требует добавочной очистки антигена. Подготовка взвеси живой культуры на физиологическом растворе для внутривенной ступенчатой инъекции позволяет активизировать процесс генерации специфических антител за счет генерализованного распространения иммунизирующего агента током крови и непосредственной его доставки к органам, ответственным за выработку специфических антител, а ступенчатое инъецирование антигена способствует предварительной сенсибилизации клеток, ответственных за продукцию иммуноглобулинов. Непосредственное внутривенное ступенчатое введение живой культуры в отличие от гомогената по прототипу способствует повышению степени и скорости иммунного ответа.

Возможность практического осуществления предлагаемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Берут двух кроликов весом 2,5-3,5 кг (при условии, если нам нужно получить около 40-70 мл сыворотки). Готовят субкультуру штамма B.abortus 3143 на заведомо проверенном твердом питательном агаре. Субкультуру штамма B. abortus 3143, стабильно сохраняющую R-форму, получают при использовании известной методики клонирования бактериальных культур (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976). Отсевают на 2 косяка и инкубируют их в течение 3 суток при 37^oC в термостате. Используя эти 2 косяка, засевают 1 матрац с твердым питательным агаром и выдерживают его в термостате при 37^oC двое-трое суток. Затем смывают стерильным физиологическим раствором в количестве 5-7 мл бакмассу с матраца и проверяют ее на чистоту, а также с S- и R- сыворотками (чтобы убедиться в том, что субкультура находится в R-форме), определяют концентрацию биомассы. Готовят взвесь бактерий в концентрации 20 млрд. мк/мл. Вводят 2 кроликам внутривенно взвесь субкультуры, стерильно приготовленную на физиологическом растворе по 1 мл каждому, при ее концентрации 20 млрд. мк/мл дробно по методу Безредко (т.е. вводят сначала 0,2 мл, а потом через 30 минут 0,8 мл). Затем через 9 дней вводят внутривенно еще по 1 мл этой же взвеси, как было описано выше в той же концентрации. Через 1 месяц после второго введения кроликов обескровливают. Для этого у них тщательно выстригают шерсть в области груди, кожу обрабатывают настойкой йода и после этого приступают к пункции сердца и отбору крови в пробирки, предварительно подготовленные и обработанные стерильным физиологическим раствором. Затем пробирки со взятой свежей кровью ставят в термостат на 30-40 минут при 37^oC или водяную баню на 30-40 минут при 37^oC. Через 30-40 минут достаем их из термостата и образовавшийся сгусток крови отделяют от стенок пробирок круговыми движениями капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой. После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при 4^oC на 12-16 часов. После этого полностью отделившуюся сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. За двое-трое суток до того, как получить окончательно сыворотку, отсевают проверенный вакцинный штамм B.abortus BA-19 для абсорбции сыворотки. Абсорбцию проводят следующим образом. К 10 мл сыворотки добавляют 3,5 мл бакмассы штамма B.abortus BA-19 в S-форме при ее концентрации 100-150 млрд. мк/мл, тщательно перемешивают и ставят на 12-16 часов при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 12000 об/мин 30 минут и отбирают сыворотку. Для консервации полученной R- сыворотки и исключения возможности остаточной концентрации после центрифугирования клеток штамма B.abortus BA-19 добавляют фенол из расчета на полученный объем сыворотки до его конечной концентрации 0,5% и затем уже хранят в холодильнике при +4^oC 1 год. После одного года хранения сыворотку подвергают повторному контролю. На этапе окончания получения сыворотки не титруем пробирочным методом в стандартной реакции агглютинации, предварительно разведя ее 1:10 физиологическим раствором, к шероховатым и гладким штаммам бруцелл. В контроле ставят реакцию агглютинации с S- сывороткой, с физиологическим раствором, с антигеном. Отбирают сыворотку с титрами не менее 1:640 против шероховатых форм бруцелл и не более 1:20 против гладких форм.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в биотехнологии позволит организовать экологически безопасную и простую технологию производства сыворотки к бруцеллам, находящимся в R-форме.

Изобретение предназначено для изготовления диагностической сыворотки к бруцеллам в R-форме. Получают культуру R-антигена из субкультур штамма B. abortus, стабильно сохраняющих R-форму. Для этого инкубируют их на плотном питательном агаре и на матрацах при 37^oC в обычных условиях. Контролируют выросшую культуру на чистоту. Далее готовят взвесь живой культуры бруцелл в физиологическом растворе. Полученной взвесью антигена двукратно иммунизируют кроликов внутривенно дробными дозами с извлечением иглы. Обескровливают их через один месяц после последней инъекции. Абсорбируют сыворотку бактериальной массой S-антигенов. Затем осуществляют контроль на наличие агглютинации к шероховатым формам бруцелл. Изобретение упрощает технологию производства сыворотки и повышает ее выход.

Способ получения диагностической сыворотки к бруцеллам в R-форме, включающий выращивание культуры R-антигена из штамма-продуцента путем инкубирования на плотном питательном arape и на матрацах при 37°С в обычных условиях, контроль культуры на чистоту, подготовку взвеси антигена с последующей двукратной иммунизацией полученной взвесью антигена кроликов и обескровливанием их через один месяц после последней инъекции, абсорбцию сыворотки бактериальной массой S-антигенов и ее контроль на наличие агглютинации к шероховатым формам бруцелл, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента для выращивания культуры R-антигена используют субкультуры штамма B.abortus, стабильно сохраняющие R-форму, для инъекции готовят взвесь живой культуры на физиологическом растворе, а иммунизацию кроликов осуществляют внутривенно двукратной инъекцией частями дискретно по времени.