СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 A61K39/10 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве препаратов для диагностики бруцеллеза.

Известен способ получения диагностикума для серодиагностики бруцеллеза (Вершилова П. А. , Бруцеллез, М., 1961, С. 199-200). По этому способу бакмассу, выращенную на плотной питательной среде из бруцелл вида B.abortus, смывают 12% раствором хлорида натрия, доводят до концентрации 3х10 КОЕ/мл, обеззараживают при 60^oC в течение 60 мин, охлаждают и добавляют водные растворы красителей - бриллианта-грюн и генцианвиолета и фенол.

Диагностикум применяется при серологической диагностики бруцеллеза для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле (Хеддльсона) и объемной реакции агглютинации (Райта). Однако может давать ложноположительные результаты при туляремии, иерсиниозе.

Известно, что более специфичными при диагностике бруцеллеза являются кислые антигены, подкрашенные красителем бенгальским розовым и ресуспендированные в молочнокислом буфере с pH 3,6 - 3,8 (Чернышева М.И. и др. Использование кислого антигена роз-бенгал в пластинчатой реакции агглютинации при бруцеллезе у людей // ЖМЭИ.-1980. - N 6. - С. 84-88).

Известно, что кислая среда способствует расщеплению S-S ковалентно связывающих между собой пептидные цепи белка, а также определяет свойства концевых NH- или COOH-групп, которые способны к ионизации, что ответственно за конформацию и химико-биологическую активность белка.

Однако подкисливание реакции на конечном этапе ресуспендирования бакмассы дает недостаточный эффект при диагностике при низком титре специфических антител.

Наиболее близким по существу и назначению является способ получения антигена для серологической диагностики бруцеллеза (А.с. СССР N 1713592, A 61 K 39/10, G 01 N 33/351, опубл. 23.02.92. Бюл. N 7).

Согласно этому способу основой для приготовления антигена служат вакцинный штамм Brucella abortus 19 и бруцеллезный бактериофаг Тб.

Бруцеллезный бактериофаг адсорбируют на клетках бруцелл из расчета 10-100 фаговых корпускул на 1 микробную клетку в течение 22-24 ч при температуре 2-4^oC, затем взвесь центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 30 мин и сливают надосадочную жидкость. Из бруцелл, находящихся в осадке, готовят взвесь на 0,5% карболинизированном физиологическом растворе, затем суспензию окрашивают краской роз-бенгал и заводят лимонно-фосфатным буфером (pH 3,6), приготовленным на 5% растворе хлорида натрия.

Полученный по этому способу антиген отличается высокой чувствительностью, сыворотки с низкими титрами антибруцеллезных антител дают положительные результаты как в РСК/РДСК, так и в РА и РБП.

Это обусловлено комплексным повышением активности антигена за счет введения в него специфического бактериофага и подкисления среды на этапе ресуспендирования.

Однако применение этого способа в серийном производстве препаратов нереально: он сложен в исполнении, требует большого расхода бактериального материала, наличие специфического бруцеллезного бактериофага, операция центрифугирования взвеси опасна для обслуживающего персонала.

Целью изобретения является упрощение технологии приготовления антигена для серологической диагностики бруцеллеза с необходимой чувствительностью и специфичностью, позволяющей использовать полученный препарат комплексно в серологических реакциях.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает выращивание вакционного штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде, смыв культуры цитратным буфером с pH 5,3 - 5,5, инактивацию бактериальных клеток нагреванием, ресуспендирование взвеси 12% раствором хлорида натрия для конечной концентрации 2 • 10¹⁰ КОЕ/мл, добавление красителя метиленового голубого и консерванта - фенола.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Смыв выращенной бакмассы с pH 5,3 - 5,5 с помощью 0,1 М цитратного буфера и поддержание такой же среды в процессе ресуспендирования 12% раствором хлорида натрия обеспечивает химико-биологическую активность антигена, а следовательно, его чувствительность и специфичность в различного типа серологических реакциях.

Ресуспендирование бакмассы до концентрации 2 • 10¹⁰ КОЕ/мл и использование доступного красителя метиленового голубого снижает себестоимость получаемого препарата.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примером конкретного выполнения.

Пример 1. Бакмассу на основе вакционного штамма B.Abortus 19 выращивают на агаре Альбими. Культуру смывают 0,1 М цитратным буфером (pH 5,3 - 5,5). Проводят обеззараживание нагреванием при 85^oC в течение 90 минут. После установления факта специфической стерильности доводят взвесь 12% раствором хлорида натрия до конечной концентрации 2 • 10¹⁰ КОЕ/мл.

Добавляют краситель и консервант: на 1 л бактериальной взвеси 0,002 л 1% водного раствора метиленового голубого и 0,005 л расправленного фенола.

Препарат выдерживают на холоду при +4C и стандартизируют.

Испытание препарата в реакции агглютинации на стекле (Хеддльсон) и в объемной реакции агглютинации (Райта) показали его высокую чувствительность: так, в реакции Хеддльсона со специфической бруцеллезной сывороткой агглютинации наступала практически моментально (через 10 - 15 сек); в реакции Райта с аналогичной сывороткой диагностикум давал агглютинацию до титра сыворотки. Специфичность препарата оценивалась с реакции агглютинации с гомологичными сыворотками (туляремийной, иерсиниозной). При этом отмечено снижение титра неспецифических реакций.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в биотехнологии позволит организовать серийный процесс производства высокоэффективного антигена для диагностики бруцеллеза.

Применение антигена по заявляемому способу позволит снизит число неспецифических серологических реакций при диагностике бруцеллеза при сохранении высокой чувствительности.

Изобретение предназначено для производства препаратов для диагностики бруцеллеза. Выращивают вакцинный штамм Brucella abortus 19 на плотной питательной среде. Смывают выросшую культуру цитратным буфером с рН 5,3 - 5,5. Инактивируют бактериальные клетки нагреванием. Проводят ресуспендирование взвеси инактивированных бактерий 12% раствором хлорида натрия до конечной концентрации 2 х 10¹⁰ КОЕ/мл. Добавляют краситель метиленовый голубой и консервант фенол. Полученный диагностикум используют в серологических реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. Применение антигена позволит снизить число неспецифических серологических реакций при диагностике бруцеллеза при сохранении высокой чувствительности.

Способ получения антигена для диагностики бруцеллеза, включающий выращивание вакцинного штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде, смыв выросшей культуры, инактивацию нагреванием, ресуспендирование, окрашивание, отличающийся тем, что смыв выросшей культуры проводят 0,1 М цитратным буфером с pH 5,3 - 5,5, ресуспендирование взвеси осуществляют после инактивации 12% раствором хлорида натрия до концентрации 2 • 10¹⁰ КОЕ/мл, затем в раствор добавляют краситель метиленовый голубой и фенол.