Изобретение относится к новой субстанции 300, способу ее получения из желудочного сока человека и животных и применению в терапевтических целях.
Известно, что желудочный сок, являющийся продуктом секреции париетальных и других клеток, содержит электролиты, соляную кислоту, ферменты (в частности пепсин, другие протеазы, ренин, липазу, уреазу и лизоцим). В настоящее время известно большое количество пептидов и их фрагментов, например пептидные гормоны - гастрины, обладающие выраженным стимулирующим действием на желудочную секрецию и впервые описанные J.S. Edkins (Proc. Roy. Sopc. L., 76B, 376, 1905).
В нормальном желудочном соке присутствуют гликопротеины (муцины), описанные F. Hanrowitz (Chem. and Biology of Proteins, 1950, с. 199) и специфический фактор (ОФ), который представляет собой термолабильный мукопротеин с молекулярной массой порядка 60 000. Этот фактор усиливает абсорбцию витамина B12 (Castle et al., Am. Med. Sci., 178, 748, 1929).
До сих пор была неизвестна субстанция из желудочного сока, обладающая очень высокой антистрессорной активностью и другими защитными свойствами.
До последнего времени желудочно-кишечный тракт, особенно желудок, считали исключительно органом - мишенью стрессорных воздействий. Никто не обсуждал возможности рассматривать желудочно-кишечный тракт, в частности желудок, как орган, в котором зарождаются защитные реакции организма. Такие реакции, направленные против стрессорных воздействий, должны проявляться в форме образования и освобождения нового эндогенного соединения. Согласно настоящей заявке, выделяют такое соединение из желудочного сока. В конечном итоге было получено желаемое вещество из желудочного сока 542 людей. Оно получило сокращенное название ЗCO (защитное соединение организма).
Это вещество имеет очень сложное строение и к настоящему времени охарактеризовано как сложенная белковая молекула с частичной аминокислотной последовательностью, начиная с N-конца: NH2-glu-glu-Pro-Pro-Pro-glu-Lus- Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-glu-Leu-Val-...-COOH.
Молекулярный вес соединения составляет около 40000± 15000 дальтон (по результатам определения методом гель-фильтрации).
Согласно настоящей патентной заявке, новое вещество получают из желудочного сока человека или животных. Для этого сок сначала гомогенизируют, затем центрифугируют, супернатант очищают диализом, ионо-обменной хроматографией и повторным диализом, после чего лиофилизируют. Окончательный продукт получают с помощью гелевой хроматографии, диализа и лиофилизации.
Сведения об этом соединении в литературе отсутствуют, и его никогда не использовали в качестве лекарственного средства.
При изучении биологического действия ЗCO ин витро и ин виво получены неожиданные результаты, свидетельствующие о наличии у него чрезвычайно широкого спектра активностей.
Известно, что очень многие заболевания и патологические состояния обусловлены стрессом, а с другой стороны, травмы или болезни могут сами служить источником стресса. Это также подтверждает, что 3CO образуется под влиянием стрессорных воздействий, независимо от их происхождения.
Полученный согласно данному изобретению 3CO изучен в экспериментах ин витро и ин виво (на крысах, морских свинках, мышах и кроликах). Было установлено, что он обладает следующими фармакологическими свойствами.
1. Острая токсичность.
Острую токсичность изучали на мышах весом 18 - 25 г обоего пола при введении 3CO внутрибрюшинно, внутривенно и непосредственно в желудок. Животных забивали на 30 день после начала экспериментов. Даже при введении 3CO в дозе 100 мг/кг, которая, по меньшей мере, в 103 - 105 раз превышала минимальную эффективную дозу, не удалось зарегистрировать летального действия препарата. В длительных экспериментах 3CO вводили внутрибрюшинно, внутривенно и непосредственно в желудок в дозе 30 мг/кг раз в день на протяжении 30 дней. Морфологические и физиологические нарушения не зарегистрированы. Средняя эффективная доза при внутрибрюшинном введении препарата колебалась от 0,071 до 60 мкг/кг, а показатель Т1 составлял не менее 1000.
2. Действие при язве, индуцированной погружением в воду или иммобилизационным стрессом.
При испытаниях использовали самцов крыс весом 180-240 г (линия Уистар). Животных погружали в холодную воду (26o) на 3 часа или иммобилизировали их на срок до 48 часов. По окончании экспериментального воздействия животных забивали для исследования на наличие язвенных поражений желудка (стрессорных язв). 3CO вводили внутрибрюшинно и непосредственно в желудок в дозах от 0,1 до 10 мкг/кг за час или 24 часа до индукции поражения. Установлено выраженное защитное действие препарата, предотвращающего развитие изъязвлений.
3. Язвы, вызванные перевязкой желчного протока и печеночной артерии или введением цистамина.
Для экспериментов по перевязке использовали самцов крыс весом 160 - 250 г (линия Уистар). Перевязка желчного протока и печеночной артерии вызывала тяжелые ишемические некротические поражения печеночной ткани и, кроме того, желудка и двенадцатиперстной кишки спустя 6 - 24 часа после начала испытаний.
Сходным образом введение подкожно 400 мг/кг веса тела цистамина спустя 24 часа вызывало язвы двенадцатиперстной кишки у самок крыс.
3CO вводили внутрибрюшинно в дозах от 0,1 до 10 мкг/кг. Препарат эффективно предотвращал возникновение у животных крупных язв после описанной перевязки желчных протоков и печеночной артерии. Точно так же предотвращалось возникновение язв желудка и двенадцатиперстной кишки у животных, получавших цистамин.
4. Действие на индуцированный инфаркт миокарда.
Самцов крыс линии Уистар весом 180 -230 г иммобилизировали на 24 часа. После этого им вводили 25 мг/кг индометацина (подкожно) одновременно с началом иммобилизации и спустя 12 часов. ЗCO в дозе 50 мкг/кг вводили за час до иммобилизации и спустя 6 и 18 часов после ее начала.
Животных второй группы обездвиживали на срок 48 часов. По окончании экспериментов животных обеих групп забивали для изучения ферментативной активности. Регистрировали защитное действие препарата.
Установлена очень высокая протекторная эффективность ЗCO. В то же время он не обладал защитным действием в отношении сердечных расстройств, индуцированных внутрибрюшинным введением изопреналина в дозе 30 мг/кг. Последний вводили в начале эксперимента и спустя 24 часа, а ВПЦ (50 мкг/кг) за час до изопреналина. Животных забивали через 24 часа после второй инъекции изопреналина и проводили необходимые исследования.
5. Влияние на артериальное давление.
После уретанового наркоза в сонную артерию самцов крыс весом 180 - 220 г вводили канюлю и с помощью динографа измеряли кровяное давление. ЗCO вводили внутривенно в яремную вену в дозах от 10 мкг до 5 мг/кг веса тела. У подготовленных таким образом к испытаниям животных изменения кровяного давления не зарегистрированы. Кратковременные изменения артериального давления индуцировались введением норадреналина, адреналина, 5-окситриптамина, ацетилхолина или изопреналина (внутривенно). У животных, которым предварительно вводили от 10 мкг до 5 мг/кг ЗСО, изменения артериального давления под воздействием перечисленных вазоактивных соединений отсутствовали.
6. Влияние на пораженную печень.
Эксперимент проводили на самцах крыс линии Уистар весом 180 - 250 г. Производили перевязку желчного протока и печеночной артерии. Эта процедура вызывала тяжелые ишемические некротические поражения печеночной ткани спустя 6 - 24 часа после начала воздействия. ЗСО вводили внутрибрюшинно в дозах от 0,1 до 10 мкг/кг. Препарат в значительной степени (при введении за час до перевязки) или полностью (при введении вскоре после перевязки) предотвращал развитие этих изменений. Кроме того, было показано защитное действие ЗСО на печень при его внутрибрюшинном введении в дозе 10 мкг/кг за час до интоксикации, вызванной введением в желудок или внутрибрюшинно четыреххлористого углерода в дозах от 0,1 до 10 мл/кг. ЗСО обладал также способностью предотвращать изменение содержания жирных кислот, вызванное стрессом в форме 48-часовой иммобилизации животных при внутрибрюшинном или внутрижелудочном введении в дозах от 0,01 до 10 мкг/кг веса тела.
7. Влияние на пораженную поджелудочную железу.
Использовали самцов крыс линии Уистар весом 170-240 г. Поражение поджелудочной железы вызвали перевязкой желчного протока в месте его вхождения в двенадцатиперсную кишку, которая сопровождалась тяжелыми некротическими изменениями ткани спустя 24 часа и гибелью примерно 50% крыс на протяжении экспериментального периода. 3CO, вводившийся внутрибрюшинно в дозах 0,1 -10 мкг/кг, пропорционально дозам ингибировал последствия перевязки, оказывая также выраженное благотворное действие на выживаемость животных (последняя возрастала примерно на 82%).
8. Влияние на пораженные почки.
а. Односторонняя нефрэктомия
Для экспериментов использовали крыс линии Уистар весом 190 - 250 г (самцов и самок). После односторонней нефрэктомии у получавших 3CO и контрольных животных оценивали изменения веса оставшейся почки. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 10,0 мкг/кг за час до операции, а оценку его действия производили спустя 24 часа после нее. Было показано, что ЗСО значительно уменьшает прирост веса оставшейся почки. Биохимические параметры у животных обеих групп существенно не отличались. В связи с этим полагают, что ЗСО улучшает функцию оставшейся почки.
б. Введение гентамицина.
Эксперименты проводили на самцах крыс линии Уистар. Повреждение почечных канальцев вызывали введением гентамицина в дозе 40 мг/кг (внутрибрюшинно) раз в день на протяжении 30 дней. Всех животных забивали спустя 5 дней после последней инъекции. У животных контрольной группы, получавших гентамицин и физиологический раствор, зарегистрировано поражение почечных канальцев. Тяжесть этих нарушений у крыс, которым вводили ЗСО, была значительно ниже.
9. Действие при экспериментальном сахарном диабете.
У самцов крыс линии Уистар весом 175 - 330 г введением алоксина или стрептозотоцина вызывали сахарный диабет. ЗСО в дозах от 10 до 100 мкг/кг (внутрибрюшинно) задерживал развитие стрептозотоцинового диабета. Кроме того, препарат значительно увеличивал продолжительность жизни животных.
10. Действие при лихорадочных состояниях.
Антипирогенное действие ЭСО изучали на самцах крыс линии Уистар весом 180 - 220 г, которым вводили пивные дрожжи. ЗСО вводили однократно в дозе 5 - 20 мкг/кг (внутрибрюшинно) за час до инъекции дрожжей.
Наблюдали выраженное снижение температуры, которую измеряли с 30- минутными интервалами на протяжении, по меньшей мере, 3 часов.
11. Действие на отечность, индуцированную каррагенином.
Экспериментальные отеки вызывали у самцов мышей весом 18-24 г (самцов и самок) введением в заднюю лапу каррагенина. 3CO оказался эффективным при внутрибрюшинной инъекции в дозе 10 мкг/кг за час до каррагенина. Он значительно уменьшал объем индуцированного отека. Кроме того, та же доза 3CO, в отличие от опиоидных антагонистов, оказалась неэффективной при испытаниях на мышах.
12. Действие при экспериментальном рините.
Крыс обоего пола линии Уистар подвергали воздействию паров 10%-го формалина ежедневно на протяжении 15 дней по часу в день. 3CO вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг ежедневно за час до экспозиции. Забой животных производили спустя 13 - 15 дней после начала эксперимента. Препарат вызывал значительное уменьшение отечности слизистой носа на фоне сохранения эпителиальной ткани, чего не наблюдалось у крыс контрольной группы. Выделения из носа носили катаральный, а не гнойный характер.
13. Действие при экспериментальных переломах.
Влияние 3CO в дозе 10 мкг/кг при внутрибрюшинном введении изучали на крысах с экспериментальными переломами костей голени. Гистологические исследования выявили значительное ускорение заживления костной ткани по сравнению с контролем при введении ЗCO после травмы. Помимо этого, препарат значительно уменьшал локальные гематомы.
14. Действие при экспериментальных ожогах.
Для экспериментальных ожогов кожи и слизистой носа использовали мышей весом 20 -25 г. При сравнении с животными контрольной группы, получавшими физиологический раствор, наблюдали ускорение заживления пораженных тканей и уменьшение гнойных выделений у мышей, которым за час до экспериментальной травмы внутрибрюшинно вводили 10 мкг/кг ЗCO.
Кроме того, у животных с пораженной слизистой носа в случае введения ЗCO посттравматическое опухание передней части головы было выражено значительно слабее, чем в контроле, носовое дыхание ухудшалось незначительно, а выживаемость не изменялась. Эти результаты явно проти-воречат данным, полученным при исследовании животных контрольной группы.
15. Влияние на кожные раны.
Эксперименты проводили на крысах линии Уистар весом 170 - 210 г. Кожные раны вызывали надрезом кожи на большом протяжении. ЗCO вводили внутрибрюшинно в форме однократной дозы 10 мкг/кг непосредственно перед нанесением раны. В отличие от животных контрольной группы у подопытных крыс отечность и нагноение отсутствовали, процессы грануляции были выражены слабо, а общая скорость заживления ран значительно возрастала.
16. Нейрофармакологическое действие.
а. Проведенные Ирвингом нейрофармакологические исследования показали, что ЗСО при введении даже в дозах, которые в тысячи раз превышали терапевтически эффективные, на различных моделях (20,0 и 40,0 мкг/кг внутрибрюшинно или перорально) не вызывали существенных изменений поведения животных по сравнению с мышами контрольной группы.
б. При воздействии ЗСО в концентрации 30 мкг/мл раствора Рингера-Лока на изолированное сердце крыс он не вызывал существенных изменений интенсивности и частоты сокращений (при подготовке препарата по методу Лан-гендорфа).
в. На модели изолированного сегмента подвздошной кишки крыс, морских свинок или кроликов (метод Магнуса) введение ЗСО в вышеуказанных дозах не влияло на тонус кишечной ткани или индуцирующее ее сокращение действие ацетилхолина, гистамина и серотонина.
17. Влияние ЗСО на гиперчувствительную реакцию замедленного типа (ГРЗТ) на ДНФБ.
Использовали модель ГЗТ для исследования реакции ДНФБ на мышах линии NMRI. У животных, которых предварительно обрабатывали двумя сенсибилизирующими дозами ДНФБ, толщина ушей и лап была значительно больше, чем у контрольных мышей. После введения мышам ЗСО (внутрибрюшинно в дозе 0,1 мкг/10 г веса тела за час до сенсибилизирующей дозы DNFB) различия в толщине ушей и лап до и после обработки DNFB были намного слабее, чем в контроле.
18. Влияние на размер зрачка.
В экспериментах на мышах весом 18-22 г (самцах и самках) производили вливание ЗСО в левый глаз животных, после чего, используя монокулярную линзу, измеряли зрачок. Кроме того, животным дополнительной группы препарат вводили внутрибрюшинно. Полученные результаты показывают, что топическое нанесение ЗСО вызывает сужение зрачка. При его внутрибрюшинной инъекции также отмечали сужение зрачка примерно на 20%. Этот эффект сохранялся на протяжении, по меньшей мере, 30 минут.
19. Влияние ЗСО при повреждении толстой кишки.
Контактную гиперчувствительность у мышей индуцировали воздействием ДНФБ (2,4-динитрофторобензола). Животные получали две сенсибилизирующие дозы препарата, разведенного до 0,5%-ой концентрации в смеси ацетона и оливкового масла (4:1). Препарат в количестве 25 мкл наносили на выбритую кожу брюшной стенки в течение двух последовательных дней. Через 72 часа после последней дозы производили трансректальное введение 20 мкл 0,2%-го ДНФБ под эфирным наркозом. Спустя 24 часа животных забивали и исследовали состояние толстой кишки. Основными патологическими изменениями, выявленными при таком осмотре, были тяжелые геморрагия (кровотечение) и изъязвление. У некоторых животных они развивались по всей длине кишки, вызывая перфорацию кишечной стенки.
Применение ЗСО в дозе 0,1 мкг/10 г веса тела через час после трансректального введения ДНФБ значительно снижало частоту указанных нарушений толстого кишечника. Основным среди них оставалась петехиальная геморрагия.
20. Действие на опухолевые клетки.
а. В стандартных условиях ин витро культивировали две клеточные линии L - 924 и меланомы В-16. ЗСО тестировали на этих культурах по действию на клеточный рост. Препарат вводили в культуры через 2 дня после начала роста в концентрациях 3 или 0,3% (0,1 мл). Спустя 3 дня с помощью счетчика клеток подсчитывали их количество в культурах. Результаты показывают, что ЗСО ингибировал рост обеих клеточных линий.
б. Асцитная опухоль Эрлиха может развиваться у мышей любой линии. Развитие происходит в форме асцитной или плотной опухолей в зависимости от способа инокуляции опухолевых клеток. Мы проводили наблюдения с целью выяснить, влияют ли инкубация клеток асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ) в растворе ЗСО на их выживаемость после подкожного или внутрибрюшинного введения мышам.
Животные находились под наблюдением на протяжении 45 дней. В качестве контроля использовали самцов мышей линии NMRI, которым вводили клетки АОЭ в количестве 0,4•106 (15 животных). Перед введением клетки инкубировали в физиологическом растворе при 4o в течение часа. Объем инокулята 0,2 мл. Средняя продолжительность жизни животных этой группы составляла 36 дней и лишь 3 из 15 мышей прожили 45 дней.
15 мышам линии NMRI подопытной группы вводили такое же количество опухолевых клеток и в том же объеме, однако предварительно их инкубировали в растворе ЗСО при концентрации последнего 2 мкг/л мл. На протяжении 45-дневного периода наблюдений погибли только 2 животных, остальные жили дольше. Различия в уровне смертности среди контрольных и подопытных мышей были статистически достоверными (p<0,01).
При внутрибрюшинном введении опухолевых клеток вместо подкожного различия в смертности мышей обеих групп отсутствовали.
Делается вывод, что ЗСО увеличивает продолжительность жизни животных после введения последним опухолевых клеток и, таким образом, обладает антиканцерогенным действием.
21. Влияние на радиационные повреждения.
Эксперименты проводили на мышах обоего пола (64 животных) линии NMR-Y при весе тела 22-28 г.
16 мышей контрольной группы не подвергали радиационному воздействию и не вводили им ЗСО.
16 мышам второй контрольной группы вводили 0,2 мл физиологического раствора, а затем облучали супралетальными дозами Co60 (9 Гр).
Животных двух экспериментальных групп (по 16 мышей в каждой) облучали той же дозой радиоактивности. Спустя час после облучения мышам одной из этих групп вводили 10 мкг/кг ЗСО, а мышам второй группы ЗСО вводили за час до облучения.
Введение ЗСО после облучения не изменило его последствий.
Введения ЗСО до облучения повышало выживаемость мышей спустя 12 дней на 68,75% по сравнению с другой подопытной группой.
22. Влияние на кроветворную систему.
Белым мышам вводили цитостатики (эндоксан, винкристин, адриабластин, цитозинарабинозид) в дозах, эквивалентных величинам ЛД50 (внутрибрюшинные инъекции). Животным подопытной группы за час до цитостатиков вводили 10 мкг/кг 3СО, а животным контрольной группы - физиологический раствор. Животных забивали на 3, 5, 7 и 11 дни эксперимента. Определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и абсолютное количество нейтрофилов в крови, содержание гемоглобина и показатель гематокрита. Проводили гистологическое изучение костного мозга, селезенки и печеночной ткани. На 3 день после начала эксперимента изученные показатели не отличались у животных подопытной и контрольной групп за исключением состояния клеток костного мозга, которые оставались интактными у мышей, получавших 300 на фоне аплазии кроветворных клеток у контрольных животных. На 5 день отмечали значительное увеличение количества нейтрофилов и лейкоцитов, которое нормализовалось к 7 дню. У контрольных животных нормализация происходила не ранее 11 дня.
23. ЗСО и репродуктивная функция - влияние при олигоастеноспермии.
Исследования проводили на 10 мужчинах в возрасте 30 - 40 лет с диагнозом олигоастеноспермия. Эякуляты этих пациентов получали после 3-4-дневного воздержания. Эякуляты оставляли на 30 мин для разжижения, после чего к пробам по 0,5 мл добавляли 0,5 мл среды. Контрольная среда содержала HAM-F -10 с 10 % инактивированной хордной сыворотки. В тестируемую среду дополнительно добавляли 4 мкг 300 мл. Препараты помещали на 90 мин в камеру Хорвелла при 37o в атмосфере 5% CO2 и подсчитывали количество активно подвижных, подвижных в пределах ограниченной зоны и неподвижных сперматозоидов в 1 мл эякулята.
Предварительные результаты свидетельствуют об отсутствии действия низких концентраций ЗСО на подвижность сперматозоидов. При концентрации ЗСО 4 мкг/мл относительное количество подвижных сперматозоидов значительно увеличивалось по сравнению с контролем.
24. Влияние ЗСО на репродуктивный процесс.
Изучение действия ЗСО на размножение изучали на мышах, ранее имевших три беременности. Самок спаривали с самцами на 20 день после прекращения лактации. На всем протяжении последующей беременности (19 - 21 день) производили ежедневные внутрибрюшинные инъекции ЗСО в дозе 10 мкг/кг. Животные контрольной группы в те же сроки получали равные объемы физиологического раствора. Регистрировали число потомства на самку и его вес.
Тщательный статистический анализ выявил устойчивое увеличение числа новорожденных на самку в отсутствие каких-либо различий веса потомства во все сроки исследования.
После окончания лактации самок выдерживали на протяжении еще 25 дней и снова подсаживали к самцам с целью изучения воздействия препарата на пятую беременность.
В подопытной группе отмечали повышение плодовитости самок и эффективности лактации под воздействием ЗСО по сравнению с контролем.
У потомства самок, получавших ЗСО, не отмечали развития патологических симптомов или снижение плодовитости (независимо от количества беременностей).
По-видимому, ЗСО улучшает плодовитость даже у очень старых самок. Таким образом, полученные результаты согласуются с наличием у ЗСО общего защитного действия на организм, а также с данными, полученными ин витро с использованием мужской спермы.
25. Защитное действие ЗСО на поврежденную зубную и околозубную ткань.
Задача исследования состояла в оценке действия ЗСО на резорбцию корней и околозубной мягкой ткани, вызванную механическим повреждением первых коренных зубов у крыс-альбиносов.
30 крыс в возрасте 4 недель разделяли между контрольной и подопытной группами, вводя первым физиологический раствор, а вторым ЗСО. Во всех случаях механическое воздействие осуществляли с помощью иглообразного инструмента длиной 1,9 и шириной 0,6 мм, который вводили на глубину 1 мм в медиальную часть кромки десны практически параллельно медиальной поверхности коронки первого коренного зуба верхней челюсти. Продолжительность воздействия составляла 1 сек.
После механического воздействия животным подопытной группы вводили ЗСО в дозе 0,02 мл/200 г. Животных (по 12 в группе) забивали на 1, 3, 5, 6, 14 или 21 день после последнего воздействия.
После удаления правой верхней челюсти крыс контрольной и экспериментальной групп ее фиксировали в 10%-ом нейтральном забуференном формалине, деминерализировали обработкой муравьиной кислотой, погружали в парафин и получали серийные срезы ткани в медиодистальной плоскости толщиной 6 мкм. Среды окрашивали гематоксилином с эозином и исследовали под световым микроскопом.
При гистологическом исследовании первого коренного зуба крыс контрольной группы выявлено присутствие большого числа воспалительных клеток. Через 1 - 3 дня после начала эксперимента наблюдали резорбцию ткани, приводившую к образованию полостей на части корневой поверхности зуба на уровне альвеолярного гребешка. На 5 день выемки расширялись в сторону зубных коронок. В них локализовалось большое количество одонтокалстов. К 7 дню процесс расширения и распространения однодонтокластов заметно прогрессировал, этот процесс продолжался на 14 и 21 дни и выемка достигала границы цементного вещества и эмали.
У животных, получавших ЗСО, в течение первых 5 дней отмечали те же изменения, что и у контрольных крыс. Однако резорбционные процессы в тканях между 14 и 21 днями не прогрессировали. Таким образом ЗСО обладал защитным действием в отношении механического повреждения зубной и околозубной ткани коренных зубов крыс.
26. Влияние ЗСО при повреждении базального ядра и спинного мозга.
При слабоумии, вызванном старческим склерозом мозга, отмечают общее нарушение высших функций коры мозга, сопровождающееся ухудшением памяти и способности к обучению. Патоморфологические исследования у больных с этими расстройствами выявили глубокую избирательную дегенерацию нейронов базального ядра. Эти нейроны служат основным источником наружной холинэргической иннервации коры мозга. Задача настоящего исследования состояла в оценке влияния ЗСО на пассивную реакцию избегания у крыс с двусторонним электролитическим повреждением базального ядра. Считают, что крысы с таким повреждением могут служить моделью старческого склероза мозга.
Исследование проводили на белых крысах. Всех животных (имевших и не имевших повреждения базального ядра) исследовали в тесте пассивного избегания по методу Ашфорда и Джонса. Животным с поврежденным базальным ядром вводили физиологический раствор (контрольная группа) либо внутрибрюшинно раствор ЗСО в концентрации 10 мкг/кг (подопытная группа).
Тестируемые соединения вводили: а) однократно, сразу после повреждения базального ядра, или б) раз в день на протяжении 4 последовательных дней после повреждения. ЗСО также вводили раз в день в течение 4 дней и за час до проведения теста избегания. Характер поведения каждого животного оценивали через 20 дней после операции. Статистическую оценку результатов производили с помощью комбинированной методики вариационного анализа и критерия Дункана для множественных сопоставлений (р <0,05). Проведенные исследования показали, что:
двустороннее электролитическое повреждение базального ядра ухудшает реакцию пассивного избегания у крыс,
ЗСО в использовавшейся дозе не влиял на поведение крыс в этом тесте в отсутствие повреждения базального ядра,
у крыс с поврежденным базальным ядром ЗСО улучшал реакцию пассивного избегания.
27. Влияние ЗСО на моторную активность кроликов при контузии спинного мозга.
Цель исследования состояла в оценке действия ЗСО на патологические изменения, вызванные контузией спинного мозга. С этой целью использования взрослых кроликов обоего пола, которых в условиях анестезии пентобарбиталом подвергали медио-дорзальной L1 -L6- ламиноэктомии. Контролируемое локальное повреждение спинного мозга производили по методике Альбина с соавторами. Моторную активность задних конечностей оценивали раз в день на протяжении 9 дней, используя систему Тарлова. Степень нарушений характеризовали в соответствии со следующей классификацией: 1) полная параплегия, 2) минимальные спонтанные движения, 3) животные способны стоять, но не могут перемещаться, 4) животные способны бегать на фоне спазматических явлений и отсутствия координации движений, 5) нормальная двигательная активность.
Животным контрольной группы вводили физиологический раствор, а кроликам подопытной группы производили внутрибрюшинные инъекции ЗСО в дозе 10 мкг/кг ежедневно на протяжении 9 дней.
Травма спинного мозга сопровождалась практически полной параплегией. Средний (за 9 дней после нанесения травмы) показатель моторной активности у кроликов, получавших физиологический раствор, составлял 1,3 единицы Тарлова (4 кролика) по сравнению с 2,5 единицами у животных, которым вводили тестируемый препарат (7 кроликов).
Очевидно, что ЗСО улучшал двигательную активность у кроликов с ее нарушениями вследствие травмы спинного мозга.
Полученные результаты показывают, что ЗСО является перспективным препаратом для лечения нарушений нейрональной функции (травма спинного или головного мозга) и что его следует назначать в возможно более ранние после нанесения травмы сроки.
28. Влияние 3СО на перистальтику кишечника, температуру тела и мочеиспускание.
Введение ЗСО не сопровождалось какими-либо изменениями в характере мочеиспускания, не приводило к снижению температуры тела ин виво или изменению сократительной активности кишечника (гладкой мускулатуры) морских свинок ин витро.
29. Действие на Trichinella spiralis.
Внутрибрюшинное введение концентрата ЗСО экспериментальным мышам, предварительно инфицированным личинками Trichinella spiralis, в значительной мере влияло на выживаемость животных при дозе препарата 10 мкг/кг.
30. Применение ЗСО в коммерческом свиноводстве.
1419 из общего числа 4306 здоровых свиней сразу после рождения получали внутримышечные инъекции ЗСО в дозе 10 мкг/кг. Еще 1440 животных получали препарат на 13 день жизни, за день до кастрации, а остальные 1477 служили контролем (обычная терапия препаратами железа). Спустя 4 недели после инъекции оценивали степень травматизации, частоту отбраковки, смертность, изменения веса тела и потребления корма. Однократная инъекция ЗСО сразу после рождения значительно уменьшала количество отбракованных животных и в обеих группах степень травматизма. Вес тела существенно не изменился на фоне значительного снижения потребления корма. Действие ЗСО при инфекционном поражении: У 40 поросят в возрасте 28 дней сразу после отъема от маток введением E. coli индуцировали энтероколит. 20 из них вводили ЗСО (внутримышечно по 10 мкг/кг). Спустя месяц отмечали значительное уменьшение смертности по сравнению с контролем.
В другом эксперименте смертность поросят оценивали по истечении одной недели после рождения. 400 поросят из общего числа 1200 здоровых животных, включенных в эксперимент, получали инъекции ЗСО сразу после рождения (внутримышечно в дозе 10 мкг/кг) дополнительно к обычной терапии препаратами железа. Отмечено значительное уменьшение смертности по сравнению с животными контрольной группы.
31. Противовирусная активность.
Противовирусное действие ЗСО оценивали на мышах в опытах ин виво и ин витро. Инъекции производили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг веса тела или в ушную вену. Установлено выраженное антивирусное действие препарата при энтеровирусной инфекции (Echo -типы 6, 9, 11 и 16, вирус Коксаки типов A9, B3 и B4), а также ингибирующее действие на вирусы центральной нервной системы (вирус клещевого энцефалита, хориоменингита и арбор-вирусы (Тахина, Бханья и Калово). Продолжительность жизни инфицированных мышей после введения ЗСО возрастала, по меньшей мере, до 72 часов или смертность под воздействием заражения вообще отсутствовала.
Отдельные аспекты настоящего изобретения описаны в нижеследующем тексте.
Методические вопросы.
С методической точки зрения важно установить, можно ли с помощью фармакотерапии одновременно воздействовать на следующие состояния.
I. 1. Острый гепатит (вирусный, лекарственный, токсический, скоротечный, независимо от этиологии).
2. Хронический гепатит.
3. Цирроз печени.
4. Задержка выделения желчи.
5. Желчно-каменная болезнь.
6. Воспаление желчных протоков.
7. Пересадка печени (терапия до и после операции).
8. Терапия до и после операции при других видах хирургического вмешательства на печени (например при врожденных уродствах, доброкачественных и злокачественных стенозах желчных протоков).
II.9. Профилактика воспалений поджелудочной железы.
10. Уменьшение тяжести клинического течения воспалительных заболеваний поджелудочной железы.
11. Уменьшение частоты послеоперационных панкреатитов.
12. Предупреждение осложнений и смертности при остром панкреатите.
13. Снижение частоты хронического панкреатита.
III.14. Острые геморрагии в верхних отделах желудочно-кишечного тракта.
15. Эрозивный гастрит.
16. Острые приступы язвенной болезни (язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, т.н. "стрессорные язвы").
17. Хроническая язва желудка.
18. Язва иных отделов пищеварительного тракта.
IV. 19. Шок любой этиологии.
V. 20. Защита паренхимальной ткани почек от острого и хронического ишемического и геморрагического некроза.
21. Острая и хроническая почечная недостаточность, а также все состояния, провоцирующие ее.
VI. 22. Скелетная травма (переломы).
23. Оперативные вмешательства на скелетных элементах (иссечение костной ткани).
24. Пересадка костной ткани.
25. Псевдоартроз.
26. Хирургическая фиксация суставов.
27. Раны (ускорение заживления, заживление per primam).
28. Ожоги (кожа и слизистые, ускорение заживления).
29. Противоопухолевое действие.
VII. 30. Антивоспалительное, противоотечное, антиревматическое действие.
31. Жаропонижающее действие.
32. Ревматоидный артрит.
33. Остеопороз.
34. Анкилозирующий спондилоз.
35. Урикальный артрит.
36. Внесуставной ревматизм (воспаление сумки, сухожилий, синовиальной оболочки; плече-черепной периартрит).
37. Воспаление и отечность после хирургической операции, при вывихах и переломах.
IX. 38. Острый инфаркт миокарда.
39. Миокардит.
40. Задержка ишемических изменений ткани.
X. 41. Уменьшение аппетита.
XI. 42. Гиперпролактинемия.
XII. 43. Болезнь Паркинсона, паркинсонизм.
XIII. 44. Глаукома (снижение внутриглазного давления, допамино- и пилокарпиноподобная активность).
XIV. 45. Сахарный диабет.
XV. 46. Интоксикация барбитуратом.
XVI. 47. Стресс и сопутствующие ему вредные воздействия.
Состояние методического обеспечения.
В настоящее время отсутствуют всеобъемлющие и специфические методы фармакотерапии и лечение осложнений осуществляется иными способами.
Описание подходов к решению методических проблем.
До настоящего времени пищеварительный тракт и особенно желудок считались исключительно объектами стрессорных воздействий. Вопрос об их возможной роли в качестве источников защитных реакций организма не рассматривался, в частности применительно к желудку. Вещество, индуцирующее, опосредующее и контролирующее защитные реакции, впоследствие названное нами БПЦ, было получено из желудочного сока 542 людей, а также животных, с помощью диализа, ионообменной фильтрации и гелевой хроматографии. После этого действие ЗСО (хотя структура его до конца неясна) было испытано на моделях различных заболеваний человека в экспериментах ин виво и ин витро. На основании полученных результатов сделан вывод о возможности применения ЗСО для лечения самых разнообразных патологических состояний в качестве нового фармакотерапевтического средства.
Выделенное вещество, получившее сокращенное название ЗСО, ранее не было известно и никогда не применялось для целей фармакотерапии.
Испытания этого препарата на большом числе видов животных (крысы, мыши, морские свинки и др.) проводят в опытах ин виво, а также на клетках человека ин витро.
Индуцированные поражения печени, поджелудочной железы, желудка и двенадцатиперстной кишки.
Медиальную лапаротомию проводили под легким эфирным наркозом. После этого дистально по отношению к двенадцатиперстной кишке производили перевязку желчного протока в месте подхода к нему слева печеночной артерии, несколько ниже портальной вены. Артерию перевязывали вместе с желчным протоком, оставляя интактной полую вену выше лигатуры. После этого рану зашивали, а животных оставляли до забоя или естественной смерти.
Медиальную лапаротомию проводили под легким эфирным наркозом, желчный проток перевязывали непосредственно перед входом его в двенадцатиперстную кишку. Рану зашивали, животных оставляли до забоя или спонтанной гибели.
Животных погружали в воду при температуре 26o на 3 часа (при глубине 20 см). По истечении указанного времени животных забивали. В течение 24 часов до начала эксперимента животные не получали корм при сохранении свободного доступа к воде.
В условиях слабого эфирного наркоза производили медиальную лапаротомию для перевязки привратника. После наложения шва на рану животных забивали (спустя 15 минут после перевязки).
Животных иммобилизировали на 24 часа. Одновременно с иммобилизацией и через 12 часов после ее начала вводили индометацин. Забой производили через 24 часа после начала эксперимента.
Экспериментальные переломы, раны, кожные ожоги.
Для перелома большеберцовой кости использовали аппарат с цифровой регулировкой в условиях слабого эфирного наркоза. Животных забивали спустя 5, 8, 9, 12 и 30 дней после экспериментального перелома.
Обширные кожные раны наносили под легким эфирным наркозом. В течение первых 5 дней после этого животных забивали ежедневно, а затем раз в три дня до 15 дня эксперимента. По другой схеме забой производили до истечения первого пятидневного срока, продолжая его на протяжении месяца после нанесения раны.
С помощью специального прибора для прижигания под легким эфирным наркозом в течение 5 секунд обрабатывали слизистую носа. Забой животных производили через 5, 9 и 30 дней после прижигания.
Индуцированное поражение почек.
Под легким эфирным наркозом перевязывали ножку почки и спустя 24 часа производили забой животных. Контрольных животных после наложения шва оставляли до забоя или смерти.
Индуцированные воспаления, отеки и лихорадочные состояния.
В качестве индуцирующего воспалительный процесс средства использовали карагенин, который в виде 1%-го раствора вводили в лапу (подкожно) в дозе 0,05 мл. Объем лапы измеряли спустя 3 часа с помощью стандартной методики.
Для повышения температуры тела животным вводили сиккофермент (внутрибрюшинно в дозе 2,5 г/кг). После этого на протяжении 3 часов измеряли ректальную температуру.
Индуцированное сердечное расстройство.
Животных обездвиживали на 24 часа. В начале иммобилизации (0 часов) и спустя 12 часов вводили индометацин. Забой производили спустя 24 часа после начала эксперимента.
Изопреналин в дозе 30,0 мг/кг вводили внутрибрюшинно в 0 и 24 часа экспериментального периода, а забой производили через 48 часов после его начала.
Индуцированные расстройства центральной нервной системы: изучение действия на спонтанное поведение животных.
Для изучения участия допаминэргических нейронов в опосредовании действия ЗСО в центральной нервной системе использовали введение апоморфинового агониста в дозе 20 мг/кг (подкожно), а также серотонина (5 мг/кг внутрибрюшинно). Контролем служили животные, получавшие 0,9% раствор хлористого натрия. После введения соответствующих препаратов наблюдали за изменениями поведения животных. Стереотипное поведение оценивали по методу Малика (1983).
Изучение действия на мышцу радужины.
Тестируемые растворы наносили топически или вводили внутрибрюшинно. Диаметр зрачка определяли в заранее выбранные сроки (через 5, 10, 15, 30, 60, 90 и 120 мин), используя стандартную методику.
Изучение действия на индуцированную барбитуратом депрессию.
В условиях анестезии пентобарбиталом натрия (50 мг/кг внутривенно) оценивали продолжительность сна, вызванного введением барбитурата, по наличию или отсутствию так называемого "рефлекса выпрямления".
Изучение действия при индуцированном диабете.
Сахарный диабет индуцировали введением аллоксана (100 мг/кг внутрибрюшинно) или стрептозотоцина (100 мг/кг внутрибрюшинно.). Концентрацию глюкозы в крови и моче определяли общепринятыми методами. Состояние животных оценивали до наступления смерти.
Оценка действия ЗСО:распределение препарата.
Исследования с применением меченного йодом-125 ЗСО показали, что его накопление в тканях происходит пропорционально дозам и продолжительности воздействия. Основное количество препарата накапливается в желудке, хотя после внутрибрюшинного или перорального введения он присутствует и в других органах.
Клинические наблюдения.
При испытаниях ЗСО на животных с экспериментальными поражениями печени, поджелудочной железы, желудка или почек, с нарушениями сердечной функции, переломами, ранами, ожогами кожи и слизистой, при сахарном диабете и др. расстройствах их состояние было значительно лучше, чем у животных соответствующих контрольных групп. В отличие от последних случаи гибели животных, получавших ЗСО, либо отсутствовали, либо частота их значительно уменьшалась.
Макроскопические и патологические наблюдения.
У контрольных животных с перевязанными желчным протоком и печеночной артерией развивалось выраженное некротическое перерождение ткани печени, которое захватывало отдельные доли и сопровождалось приобретением тканью зеленой окраски. Одновременно отмечали некроз панкреатической ткани и геморрагические явления в желудке и двенадцатиперстной кишке. Введение ЗСО эффективно предотвращало развитие этих изменений пропорционально дозе препарата. У контрольных животных они появлялись в течение первых 6 часов после перевязки, тогда как при введении ЗСО они развивались не ранее 48 часов. Патофизиологическое обследование подтвердило результаты макроскопических наблюдений и существование указанных различий.
После перевязки желчного протока при входе его в двенадцатиперстную кишку в поджелудочной железе контрольных животных развивались тяжелые некротические поражения на фоне геморрагии желудочной ткани и двенадцатиперстной кишки. ЗСО предотвращал их развитие пропорционально дозам. Патофизиологическое обследование подтвердило результаты макроскопических наблюдений и наличие отличий между контрольными и получавшими ЗСО животными.
В условиях стрессорного воздействия погружением животных в воду и иммобилизацией в сочетании с введением индометацина, а также при кратковременной (15 мин) перевязке привратника развивались тяжелые патологические нарушения в желудке. Введение ЗСО в значительной степени (или даже полностью) предотвращало это действие стресса или сопутствующих ему неблагоприятных воздействий.
У контрольных животных перевязка ножки почки вызывала тяжелое поражение этого органа. В случае введения ЗСО оно было значительно слабее. Гистопатологические исследования подтвердили результаты макроскопических наблюдений и наличие различий между контрольными и получавшими ЗСО животными.
В экспериментах по экспериментальному перелому костей ЗСО значительно ослаблял развитие гематомы, отмечавшееся у контрольных животных, нормализация двигательной функции поврежденной конечности также значительно ускорялась. Качественная оценка с помощью общепринятых методов патогистологического исследования выявила ускоренное рассасывание костной мозоли под воздействием ЗСО во все сроки наблюдений.
В течение первых нескольких дней у контрольных животных с искусственно нанесенными кожными ранами происходила интенсивная сывороточно-гнойная грануляция. При введении ЗСО рана оставалась сухой, эксудат и грануляция (per primam) отсутствовали. Патогистологические наблюдения подтвердили наличие этих изменений и соответствующих различий между контрольными и получавшими ЗСО животными во все сроки исследования.
Иммобилизационный стресс в сочетании с введением индометацина вызвал значительные изменения в миокарде, тяжесть которых была пропорциональна концентрации индометацина в крови. Введение ЗСО значительно понижало тяжесть этих нарушений и приводило к снижению показателей функциональной активности. Патогистологические исследования подтвердили результаты макроскопических наблюдений и наличие различий между контрольными и получавшими ЗСО животными.
У животных с экспериментальным диабетом ЗСО устранял временную гикозурию (после введения аллоксана). Введение ЗСО после стрептозотоцина почти в 3 раза повышало выживаемость. В обоих случаях ЗСО уменьшал полидипсию и полифагию.
Противовоспалительное, противоотечное и противолихорадочное действие.
У получавших ЗСО животных значительно уменьшалась отечность, вызванная введением карагенина, которая во все сроки наблюдений была слабее, чем у контрольных особей.
У животных, предварительно получавших сиккофермент, введение ЗСО значительно снижало степень увеличения температуры тела по сравнению с животными контрольной группы.
Результаты исследований ин витро.
Через два дня после начала культивирования линии человеческих фибробластов 1-929 и клеток меланомы B-16 к ним добавляли ЗСО. Спустя еще 3 дня подсчитывали число клеток, используя соответствующий счетчик. ЗСО оказывал выраженное, пропорциональное концентрациям токсическое действие на клетки меланомы, не влияя на рост фибробластов.
При сопоставлении с контрольными животными с экспериментальным ожогом кожных покровов животные, получавшие ЗСО, отличались ускоренным образованием защитной корки. У контрольных животных с ожогами слизистой (например слизистой оболочки носа), в течение первых двух дней развивался тяжелый отек пораженной ткани, сопровождавшийся выделением сывороточно-гнойного эксудата и частичной закупоркой носовых дыхательных ходов. У получавших ЗСО животных эти явления отсутствовали. Патогистологические исследования подтвердили результаты макроскопических наблюдений и наличие значительных различий между контрольными и получавшими ЗСО животными.
Действие на центральную нервную систему.
Действие ЗСО на центральную нервную систему изучали, оценивая изменения поведения животных (мышей).
Через 5 минут после введения препарата отмечали усиление двигательной активности. Беспокойство животных с каждой минутой возрастало, достигая пика через 30 минут. В это время животные становились на задние ноги, выпрямляясь подобно свечам, и интенсивно обнюхивали окружающие предметы. Отмечали феномен Штрауба, животные бегали по периметру клетки, развивалась пилоэрекция. Введение апоморфина сопровождалось изменениями поведения спустя 45 минут, когда животные начинали время от времени подниматься на задние лапы. Серотонин лишь на непродолжительное время индуцировал стереотипное поведение, включая усиление подвижности, обнюхивание, уменьшение частоты очистки шерсти.
Топическое нанесение препарата ЗСО в глаза или его внутрибрюшинная инъекция вызывали сужение зрачка примерно на 20% его максимального диаметра.
Введение ЗСО уменьшало продолжительность индуцированного барбитуратом сна, о котором судили по сокращению продолжительности периода отсутствия рефлекса выпрямления (по меньшей мере на 60%).
Влияние на кровяное давление, перестальтику кишечника, температуру тела и мочеиспускание.
Введение ЗСО не сопровождалось изменениями кровяного давления и действия на него адреналина, норадреналина, изопреналина, ацетилхолина и серотонина.
Добавление ЗСО к препаратам гладкой мускулатуры кишечника морских свинок ин витро не сопровождалось изменением сократительной способности ткани.
ЗСО не вызывал снижения базальной температуры тела.
Введение ЗСО не влияло на характер мочеотделения и не сопровождалось усилением диуреза.
Механизм действия.
Следует думать, что действие ЗСО, как и других экзогенных белков, является следствием одного из следующих механизмов: прямого взаимодействия белка или его фрагментов с клеточными рецепторами; стимуляции или ингибирования освобождения биологической активности (стимулирующей или ингибирующей), связанной с белками или иными соединениями, в ходе опосредуемых или неопосредуемых через рецепторы процессов; взаимодействия с ферментами, вызывающими деградацию эндогенных биологически активных пептидов.
Многочисленные проявления защитного действия при нозологически различных расстройствах легко объяснимы, если допустить, что препарат подавляет действие стрессорных факторов, сопровождающих эти заболевания. В связи с этим можно считать, что ЗСО является первичным агентом защитной реакции организма на любые стрессорные воздействия, оказывающие на него неблагоприятное влияние, а источником его служит желудок. Таким образом, механизм действия ЗСО - это механизм предотвращения вредных воздействий на организм, обусловленных стрессорными условиями.
На основании вышеизложенного делается вывод о возможности эффективного воздействия фармакологическим препаратом ЗСО на течение следующих расстройств.
I. 1. Острый гепатит (вирусный, лекарственный, токсический, скоротечный, независимо от этиологии)
2. Хронический гепатит.
3. Цирроз печени.
4. Желчно-каменная болезнь.
5. Задержка желчеотделения.
6. Воспаление желчных протоков.
7. Пересадка печени (терапия до и после операции).
8. Пред- и послеоперационная терапия при других видах хирургического вмешательства на печени (например при врожденных уродствах доброкачественных и злокачественных стенозах желчных протоков).
II.9. Профилактика панкреатита.
10. Ускорение излечения панкреатита.
11. Уменьшение частоты послеоперационных панкреатитов.
12. Профилактика осложнений и смертности при панкреатитах
13. Снижение частоты хронических панкреатитов.
III. 14. Острое кровотечение в верхних отделах желудочно-кишечного тракта.
15. Эрозивный гастрит.
16. Острые приступы язвенной болезни (язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, т.е. "стрессорные язвы").
17. Хроническая язва желудка.
18. Язва иных отделов пищеварительного тракта.
IV.19. Шок (любой этиологии).
V. 20. Защита паренхимальной ткани почек от острого и хронического ишемического и геморрагического некроза (острого и хронического).
21. Острая и хроническая почечная недостаточность, а также провоцирующие ее состояния.
VI.22. Скелетная травма (переломы).
23. Оперативные вмешательства на элементах скелета (иссечение костной ткани).
24. Пересадка костной ткани.
25. Псевдоартроз.
26. Хирургическая фиксация суставов.
27. Раны (ускорение заживления, заживление.
28. Ожоги (кожа и слизистая, ускорение заживления).
VII.29. Противоопухолевое действие.
VIII. 30. Противовоспалительное, противоотечное и антиревматическое действие.
31. Жаропонижающее действие.
32. Ревматоидный артрит.
33. Остеоартроз.
34. Анкилозирующий спондилоз.
35. Подагра.
36. Внесуставные ревматические расстройства (воспаление сумки, сухожилий, синовиальной оболочки, плече-черепной периартрит).
37. Воспаление и отечность после хирургической операции, при вывихах и переломах.
IX. 38. Острый инфаркт миокарда.
39. Миокардит.
40. Задержка ишемических изменений ткани.
X.41. Уменьшение аппетита (анорексивное действие).
XI.42. Гиперпролактинемия.
XII.43. Болезнь Паркинсона.
XIII.44. Глаукомы (снижение внутриглазного давления, допамино- и пилокарпиноподобная активность).
XIV.45. Сахарный диабет.
XV.46. Барбитуратная интоксикация.
XVI.47. Стресс и сопутствующие ему вредные воздействия.
Введение препарата осуществляют перорально или внутрибрюшинно в форме таблеток, капсул, драже, подъязычного средства, свечей, препаратов для внутривлагалищного введения, инъекций, растворов для инъекций и обработки полости носа, мазей, кремов, гелей, аэрозолей, глазных капель, жидкости для закапывания в уши или в нос.
Пример 1. Способ получения субстанции ЗСО.
Материал для выделения вещества был получен из желудочного сока 542 человек (путем многократного взятия проб воспроизводимым методом) и из желудочного сока животных.
Полученный материал хранили при температуре от +2o до -8o. Перед использованием материал гомогенизировали и центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость собирали и в объеме 200 мл диализировали в воде при +4o в разведении 1:125 до достижения уровня проводимости 100 мсек. После этого диализат лиофилизировали, сухой остаток разводили в 10 мл дистиллированной воды и наносили на хроматографическую колонку из модифицированного ионообменивающего геля, содержащего ДЭАЭ (40 - 80 мкм). Размер колонки 25 х 250 мм. Для элюции использовали натрий-ацетатный буфер (0,01 М), pH 5,2. Для идентификации фракций использовали ультрафиолетовый детектор, 280 нм. Для анализа отбирали фракции из 40 - 120 мл. элюата. Элюат сначала концентрировали аквацидом-3 (Калбиохем, США), а затем лиофилизировали.
Сухое вещество разводили в 10 мл 0,2 М фосфатного буфера pH 7,4 после чего наносили на хроматографическую колонку с набивкой из сефакрила S-200. Размер колонки 2,5 х 450 мм, скорость элюции 1,2 мл/мин. Собирали фракции из 80 - 200 мл элюата.
Раствор диализировали против дистиллированной воды, концентрировали аквацидом-3 и лиофилизировали. В результате получали приблизительно 200 мг сухого вещества белого цвета.
Характеристика.
Субстанцию ЗСО характеризовали по спектрам инфракрасного и ультрафиолетового поглощения (фиг. 1 и 2).
Учитывая описанные фармакологические свойства субстанции ЗСО, его можно использовать при некоторых заболеваниях, особенно в случаях пониженной продукции этого соединения или полного ее отсутствия в организме.
Препарат может быть также использован при лечении следующих расстройств и заболеваний.
а) Все патологические состояния, вызываемые стрессорными воздействиями.
б) Расстройства кровообращения: язвы различного происхождения, шоковые состояния независимо от этиологии, ишемия и инфаркт различных органов.
в) Воспалительные состояния и отеки: воспаления и отеки любой этиологии, гепатиты (острый и хронический), цирроз печени, холангит, панкреатиты различной этиологии, расстройства функции желудка и двенадцатиперстной кишки, нефриты и нефропатии, миокардит, перикардит, эндокардит, артроз и артрит (независимо от этиологии), ринит, ревматоидные заболевания, поражения суставов разной этиологии, лихорадочные состояния, поражения, вызванные свободными радикалами.
г) Травмы и хирургические операции: пред- и посттравматическая терапия, пересадка органов и тканей, раны, ожоги, переломы, послеоперационные осложнения.
д) Злокачественные новообразования: некоторые виды опухолей.
е) Сахарный диабет.
ж) Расстройства допаминэргического и сходного происхождения: ожирение, болезнь Паркинсона, гиперпролактинемия, глаукома, сонливость вследствие интоксикации барбитуратом.
з) Заболевания и расстройства функции нервной системы: старческий склероз мозга, ишемические и травматические поражения нервной системы, задержка старческих дегенеративных процессов.
и) Стоматология: поражения слизистой ротовой полости, хирургическое вмешательство на околозубных тканях, задержка резорбции зубных корней.
к) Кроветворная система: нейропения, апластическая анемия, миелодиспластические синдромы, трансплантация костного мозга.
л) Радиационные поражения: острый лучевой синдром и защита от острого лучевого поражения.
м) Иммунная система: аллергические реакции, гиперчувствительность, трансплантация органов и тканей.
н) Репродуктивная функция: повышение плодовитости, лечение олигоастеноспермии, стимуляция лактации.
о) Применение в ветеринарии, в коммерческом скотоводстве: снижение смертности животных, ускорение роста, лечение ушибов, улучшение утилизации корма, повышение веса тела.
п) Применение в вирусологии: противовирусная терапия.
р) Прочие случаи применения: жировое перерождение печени, задержка желчеотделения, желчно-каменная болезнь, острое и хроническое нарушение почечной функции, токсическое поражение печени и почек.
Препараты ЗСО планируется использовать для перорального, ректального и парентерального введения и топического применения. Лекарственные формы получают посредством добавления к активному препарату органических и неорганических недействующих материалов. В таблетки и драже добавляют, например, тальк, лактозу, крахмал, стеараты и т.п.; в растворы и суспензии добавляют воду, спирты, глицерин и т.п.; в состав свечей включают природные масла, твердые масла, воск или полиэтиленгликоль. В состав лекарственных форм могут, кроме того, входить необходимые консерванты, буферные растворы, сурфактанты, стабилизаторы, соединения, повышающие растворимость, сладкие добавки и красители.
Суточные дозы субстанции ЗСО колеблются от 5 до 50 мкг/кг веса тела, препарат можно вводить однократно или дробными дозами.
Пример 1. Получение 3СО из желудочного сока человека.
Исходным материалом для выделения ЗСО-субстанции служил желудочный сок 542 людей. Собранный материал хранили при температуре от +2o до -8o. Перед использованием его гомогенизировали.
Пробу материала объемом 200 мл сначала центрифугировали при 12000g в течение 30 минут, разделяя на супернатант и осаждаемый остаток. Надосадочную жидкость диализировали против деминерализованной воды в соотношении 1:125 при 4o до достижения проводимости 100 мкс. После этого жидкость лиофилизировали. Сухой остаток разводили в 10 мл дистиллированной воды и наносили на хроматографическую колонку размером 25 х 250 мм с набивкой из модифицированного гелевого ионообменника с ДЭАЭ (например трисакрил-М-ДЭАЭ, JBF). Элюцию производили 0,01 М ацетатом натрия pH 5,2. Сбор фракций производили под контролем ультрафиолетового детектора при 280 нм. Отбирали фракции элюата в диапазоне его объема от 40 до 120 мл. Собранные фракции концентрировали аквацидом-3 (Калбиохем), диализировали и лиофилизировали.
Сухое вещество разводили в 10 мл 0,2 М фосфатного буфера pH 7,4 и подвергали повторной очистке посредством хроматографирования на колонке из сефакрила S -200 (Фармация) при скорости элюции 1,2 мл/мин. Размер колонки 2,5 х 400 мм. Фракции, полученные из элюата в объеме 80 - 120 мл, диализировали против дистиллированной воды, концентрировали аквацидом-3 и лиофилизировали. В результате получали 2 мг сухого вещества белого цвета. Препарат хорошо растворим в воде, разлагается при температуре от 180 до 200o, имеет молекулярную массу (по результатам определения методом гелевой хроматографии) примерно 40000±5000 дальтон. Определение спектра ультрафиолетового поглощения в воде выявило зоны поглощения, показанные на фиг. 1.
Зоны поглощения в инфракрасной области (в KBr) показаны на фиг.2.
По химической структуре ЗСО представляет собой свернутый белок со следующей частичной аминокислотной последовательностью на П-конце: H2-glu-glu-Pro-Pro-Pro-glu-Lys-Pro-Ala-Asp-Ala-glu-Leu-Val-...-COOH.
Пример 2. Получение ЗСО из желудочного сока человека.
Гомогенизированный желудочный сок человека из того же источника, что и в примере 1, центрифугировали, диализировали и лиофилизировали с использованием процедур, описанных в примере 1.
Сухой остаток (80,4 мг) разводили в 0,1 М ацетатном буфере pH 5,22 (3 мл) и наносили на хроматографическую колонку с набивкой из ионо-обменной смолы Фрактогель-ТСК (фирмы Мерк), предварительно уравновешенной ацетатным буфером (pH 5,2). Скорость элюции составляла 0,7 мл/мин. Сбор фракций осуществляли под контролем ультрафиолетового детектора при 280 нм. Собирали начальные фракции с высоким ультрафиолетовым поглощением.
Эти фракции диализировали против дистиллированной воды, а затем лиофилизировали (47 мг).
Полученный сухой остаток снова разводили в ацетатном буфере (1 мл) и наносили на хроматографическую колонку размером 16 х 560 мм с набивкой из сефадекса g -100 (Фармация), предварительно уравновешенным ацетатным буфером. Скорость элюции составляла 0,3 мл/мин. Для анализа отбирали фракции в диапазоне объемов элюата 66 - 108 мл. Собранный материал диализировали против дистиллированной воды и лиофилизировали. В результате получали порошок белого цвета, не отличавшийся по своим свойствам от вещества, полученного по примеру 1.
Пример 3. Получение субстанции ЗСО из желудочного сока свиней.
Гомогенизированный свиной желудочный сок (85 мл) центрифугировали, диализировали и лиофилизировали, как описано в предыдущих примерах, получая таким образом 440 мг сухого остатка. Затем 110 мг этого материала разводили в 0,1 М ацетатном буфере pH 5,22 (6 мл) и наносили на хроматографическую колонку размером 10 х 50 мм с набивкой из ионо-обменной смолы фрактогель-ТСК. Последующие процедуры производили, как описано в предыдущих примерах. В результате получали 44 мг концентрата желтоватого цвета.
Часть этого концентрата (24 мг) разводили в 1 мл того же ацетатного буфера и наносили на хроматографическую колонку размером 16 х 565 мм с набивкой из сефадекса - 50/80, предварительно уравновешенного ацетатным буфером. Скорость элюции составляла 1,35 мл/мин. Фракции отбирали из элюата в диапазоне его объема от 65 до 108 мл и подвергали диализу против дистиллированной воды, а затем лиофилизировали. В результате получали 10 мг порошка белого цвета, который по молекулярной массе и другим свойствам был сходен с материалом, полученным в предыдущих примерах (в пределах точности и воспроизводимости использовавшихся аналитических методов).
Пример 4. Таблетки.
Состав - мг/таблетка
Субстанция ЗСО - 0,3
Лактоза - 37,7
Крахмал - 6,0
Тальк - 3,0
Трагакант - 2,5
Стеарат магния - 0,5 - 50 мг
Пример 5. Капсулы.
Состав - мг/капсула
Субстанция ЗСО - 0,3
Лактоза - 99,0
Стеарат магния - 0,7 - 100 мг
Пример 6. Подъязычное средство.
Состав - мг/таблетка
Субстанция ЗСО - 0,3
Маннитол - 100,0
Крахмал - 5,0
Поливинил-пирролидин - 1,5
Тальк - 3,2 - 110 мг
Пример 7. Свечи.
Субстанция ЗСО - 0,5
Полиэтиленгликоль 300 - 478,0
Полиэтиленгликоль 1500 - 529,0
Полиэтиленгликоль 6000 - 38,0
Эмульгатор - 14,5 - 1060 мг
Пример 8. Крем. - (г/25 г)
Субстанция ЗСО - 0,05
Эмульгатор - 25,0
Гидрогенизированное арахисовое масло - 50,0
Твин 60 - 120,0
Пропиленгликоль - 30,0
Метилоксибензоат - 0,16
Пропилоксибензоат - 0,17 - 250 г
Пример 9. Раствор для инъекций. (мг/мл)
Субстанция ЗСО - 0,3
Натрий-карбоксиметилцеллюлоза - 1,5
Поливинилпирролидин - 5,8
Лецитин - 2,7
Бензиловый спирт - 0,01
Буферный р-р - по необходимости
Бидистиллированная вода - 1 мл
Пример 10. Раствор. - (г/25 мл)
Субстанция ЗСО - 0,05
Глицерин - 15,0
Бензиловый спирт - 0,01
Буферный р-р - по необходимости
Бидистиллированная вода - 25 мл
Пример 11. Сухой материал для инъекций.
Состав - мг
Субстанция ЗСО - 0,3
Маннитол - 10,0 - 10,3 мг
Пример 12. Препарат для обработки носовой полости.
Состав - мг/доза
Субстанция ЗСО - 0,5
Бензиловый спирт - 0,15
Улиглиол-812 - 14,00
Фреон 12/114 - 60,00 - 74,65 мг
Пример 13. Капли для закапывания в глаза, уши и нос.
Состав - мг/5 мл
Субстанция ЗСО - 45
Стабилизатор - 5
Гидрогенфосфат натрия - 116
Дигидрогенфосфат натрия - 33
Бензалконий-хлорид - 0,5
Пример 14. Вагинальное средство.
Состав - мг/препарат
Субстанция ЗСО - 0,3
Полиэтиленгликоль 300 - 150,7
Полиэтиленгликоль 1500 - 1290,0
Полиэтиленгликоль 6000 - 700,0
Пропиленгликоль - 200,0
Твин-40 - 59,7
Лактоза - 100,0
Пример 15. Глазная мазь.
Состав - мг/3,5
Субстанция ЗСО - 45
Парафиновое масло - 1000
Эмульгатор - 100
Белый вазелин - 2355 - 3500 мгб
Изобретение относится к новой субстанции защитного соединения организма, способу ее получения и применения в целях. Изобретение включает: способ получения нового вещества из желудочного сока человека и животных и имеет следующие стадии очистки: центрифугирование, диализ, ионообменную хроматографию и лиофилизацию, а также лекарственное средство для применения в медицине и ветеринарии и способ его использования при лечении заболеваний и расстройств, индуцированных стрессорными воздействиями, воспалительных процессов, отечности, заболеваний и расстройств допаминэргической этиологии, сахарного диабета, заболеваний и нарушений функции органов желудочно-кишечного тракта, сердца, почек, поджелудочной железы, печени, мужских половых желез, кроветворных органов, скелета и нервной системы, старческого слабоумия, ран, ожогов, переломов, вирусных заболеваний, злокачественных новообразований, в хирургической практике, некоторых расстройств репродуктивной функции и иммунной системы; защиты от ионизирующей радиации и для ветеринарного применения в коммерческом животноводстве. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил.
H2N Cly Glu Pro Pro Pro Gly Zys Pro Ala Asp - Asr Ala Gly Leu Val COOH.
