МЕТИЛОВЫЙ ЭФИР (± ) 7-{2β-[1-АМИНО-3-ОКСО- 4-АЦЕТОКСИ- (1E)-БУТЕНИЛ]-5-ОКСОЦИКЛОПЕНТИЛ-1a}ГЕПТАНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОЯЗВЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ. Советский патент 1996 года по МПК C07C405/00 A61K31/557 

Предлагается новый аналог простагландинов, а именно метиловый эфир (±) 7-[2β- (1-амино-3-оксо-4-ацетокси-(1Е)-бутенил)-5- оксоциклопентил-1α]гептановой кислоты формулы
обладающий противоязвенной активностью.

Цель изобретения получение новых аналогов природных простагландинов, обладающих преимуществами в фармакологических свойствах перед известными, выражающимися в высокой избирательности действия.

П р и м е р. Раствор 0,973 г (2,66 ммоль) метилового эфира (±) 7-[2 β -(4-ацетоксиметилизоксазолил-3)-5-оксоциклопентил-1α] гептановой кислоты в 10 мл этилового спирта добавляют к взвеси каталитического количества предварительно гидрированного никеля Ренея W-2 в этиловом спирте. Гидрирование проводят водородом при атмосферном давлении и комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляется по ТСХ и количеству поглощенного водорода. По окончании реакции катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают и получают 0,857 г (88%) метилового эфира ( ± ) 7-[2 β-(1-амино-3-оксо-4-ацетокси-(1Е)-бутенил)-5-оксоциклопентил- 1 α]-гeптановой кислоты в виде светло-желтого масла.

ИК-спектр (пленка, ν): 3420, 1745, 1625 см^-1.

ПМР (CDCl₃, δ): 5,16 (С, 1Н, СН-С); 4,56 (С, 2Н, СO-CH₂-O); 3,62 (с, 3Н, СН₃-О-СО-); 2,16 (с, 3Н, СН₃-СО).

Масс-спектр: М⁺ 367. Вычислено для С₁₉Н₂₉NO₆ мол.м. 367,43.

Изучена противоязвенная активность соединения простагландиновой структуры метилового эфира ( ±) 7-[2 β -(1-амино-3-оксо-4-ацетокси-(1Е)-бутенил)-5-оксоциклопентил-1 α]гептановой кислоты (I).

Методы исследования. Противоязвенную активность соединения I изучали в опытах на белых крысах-самках массой 190-230 г, предварительно голодавших в течение 24 ч. Все животные находились в одинаковых условиях и на одинаковом пищевом режиме.

В первой серии опытов язвы желудка вызывали введением серотонина. Крысы разделены на группы по 10-20 животных. Исследуемое соединение вводили в дозах 2,5 и 5 мкг/кг подкожно, внутримышечно, в желудок 1-2 раза в сутки, контрольным животным изотонический раствор хлорида натрия. Всем крысам в начале опыта вводили подкожно серотонин в дозе 30 мг/кг, а спустя сутки 20 мг/кг. Соединение I вводили за 30 мин до инъекции серотонина, а затем через 5-6 ч после первой инъекции серотонина. Животных забивали через 27 ч после начала введения серотонина, извлекали желудки, разрезали по малой кривизне и возникшие изменения излучали микроскопически.

Подсчитывали количество обнаруженных деструктивных изменений слизистой оболочки желудка в виде язв, эрозий, кривоизлияний, измеряли площадь изъязвлений. Учитывали количество животных, у которых не наблюдалось изменения слизистой, число животных с обширными изъязвлениями, с перфорацией желудка. Обнаруженные поражения слизистой желудка суммировали, число их, приходящееся на одно животное, и средняя площадь деструкции служили показателями тяжести поражений стенки желудка.

Во второй серии опытов вызывали нейрогенные язвы желудка путем наложения кровоостанавливающего зажима Пеана на 10 мин на область двенадцатиперстной кишки. Операции проводили под легким эфирным наркозом. После нанесения травмы на пилородуоденальную область рану брюшной полости послойно зашивали. Опытным крысам вводили исследуемое соединение I в дозе 5 мкг/кг, контрольным равное по объему количество растворителя. Через 18-24 ч животных забивали, желудки извлекали и подвергали макроскопическому обследованию. Обнаруженные поражения слизистой желудка учитывали как в предыдущей серии опытов.

В третьей серии опытов экспериментальные язвы вызывали путем полной перевязки привратника желудка. Под легким эфирным наркозом в асептических условиях вскрывали брюшную полость, накладывали лигатуру на пилорическую часть желудка и рану послойно зашивали. Опытным крысам во время операции вводили исследуемое соединение в дозе 5 мгк/кг, контрольным в таком же количестве растворитель. Через 18-24 ч животных забивали, извлекали желудок, разрезали его по большой кривизне, возникшие изменения изучали макроскопическим путем. Метод оценки изменений слизистой такой, как при язве, вызванной нанесением травмы на двенадцатиперстную кишку.

Влияние соединения I на секреторную функцию желудка исследовали в опытах на белых крысах-самцах массой 200-220 г в условиях острой экспериментальной язвы. Желудочный сок для исследования получали через 1,5 и 18 ч после введения соединения I в дозе 5 мкг/кг. Показателями желудочной секреции были общая кислотность и количество свободной соляной кислоты в титрационных единицах, створаживающая активность пепсина. Определяли также содержание пепсиногена в плазме крови по количеству расщепленных в стандартных условиях белков плазмы.

Влияние соединения I на моторную функцию желудочно-кишечного тракта изучали на белых мышах-самках (20-25 г) по скорости продвижения контрастной массы по кишечнику. В качестве индикатора использовали 5%-ную взвесь угля на 2% -ном геле крахмала, которую вводили по 0,3 мл в желудок через зонд. Изучаемое соединение вводили в диапазоне доз 1-50 мкг/кг за 15 мин до опыта, контрольным животным 0,9% -ный раствор хлорида натрия. Через 20 мин после введения взвеси угля мышей забивали, вскрывали брюшную полость и извлекали тонкий кишечник. Скорость продвижения контрастной массы по кишечнику определяли по отношению длины участка кишечника, пройденного взвесью угля, к длине всего тонкого кишечника.

В серии опытов на белых мышах массой 20-25 г исследовали способность соединения I (1; 2,5 и 5 мкг/кг) при различных способах введения вызывать диарею. Наблюдение вели в течение 30 мин за каждой мышью, определяли частоту, характер и количество испражнений.

В следующей серии опытов на белых мышах-самках (20-25 г) изучали влияние соединения I в широком диапазоне (2,5-50 мкг/кг подкожно) на диарею, вызванную серотонином (5 мг/кг в вену). Последний вводили сразу после инъекции исследуемого соединения и в течение 30 мин вели учет диареи.

Полученные результаты опытов обработаны статистически по критерию Стъюдента или по таблицам достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям.

Общее действие и токсичность соединения I изучали на белых мышах (25-27 г) при однократном введении в вену, подкожно и внутримышечно. Учитывали общее состояние, поведение животных, время наступления и клиническую картину острого отравления, количество погибших животных. Показатели острой токсичности определены ориентировочно или обработаны методами вариационной статистики.

Результаты исследований и обсуждение. В серии опытов с серотониновыми язвами желудка установлено, что соединение I при введении в дозе 2,5 мкг/кг два раза в сутки проявляет заметный противоязвенный эффект. Макроскопическая картина слизистой оболочки желудка крыс, получивших испытуемое соединение, заметно отличается от таковой нелеченых животных. В опытных группах животных обнаруживалось в 2 раза меньше желудков с очень крупными язвами, практически не было деструкций с обширными кровоизлияниями (см. табл. 1). Дистрофические изменения стенки желудков проявлялись в виде мелких точечных поверхностных эрозий слизистой оболочки. В этой серии опытов защитное действие соединения I проявлялось в уменьшении на 90% средней площади поражений, хотя число изъязвлений на одно животное существенно не уменьшалось (см. табл.2).

Степень противоязвенной активности простагландиноподобного соединения зависит от пути введения и оптимальной его дозы. Более высокую противоязвенную активность проявляет испытуемое соединение при введении подкожно в дозе 5 мкг/кг (суточная доза 10 мкг/кг). В этом случае введение соединения I вызывает уменьшение на 74% среднего числа изъязвлений на одну крысу и на 61% средней площади поражений стенки желудка (см. табл. 2).

Наиболее высокая противоязвенная активность соединения I в тех же условиях опыта наблюдается в случае введения изучаемого вещества в мышцу и составляет по числу поражений на одно животное 81% по площади поражений 84% При этом у 45% опытных животных отсутствовали поражения стенки желудка, тогда как в контроле этот показатель составляет 20% (см. табл. 1 и 2).

При введении соединения I в той же дозе в желудок противоязвенная активность его несколько ниже, чем в случае внутримышечного введения, и составляет соответственно 50 и 40% (см. табл. 2). Достаточно высокая эффективность синтетического ПГ-аналога выгодно отличает его от естественных простагландинов, неэффективных при введении внутрь.

В серии опытов с нанесением травмы на область двенадцатиперстной кишки соединение I при введении в дозе 5 мкг/кг однократно в момент нанесения повреждения проявляет одинаковый противоязвенный эффект независимо от пути введения (в желудок или подкожно). При этом число деструкций слизистой оболочки как по малой кривизне, так и большой кривизне желудка уменьшается несущественно. Однако площадь изъязвлений стенки желудка при введении соединения I в желудок уменьшается на 76% подкожно на 77% Вместе с тем при нейрогенных язвах 50% пораженных желудков контрольных животных имели очень крупные язвы, тогда как при введении соединения I подкожно подобные нейродистрофические поражения стенки желудка отсутствовали (см. табл. 3).

При экспериментальных язвах желудка, вызванных перевязкой привратника (по методу Шея), соединение I в дозе 5 мкг/кг подкожно уменьшает число случае прободений желудка и появление обширных изъязвлений стенки желудка по сравнению с контрольными животными. В этой серии опытов наблюдается уменьшение площади деструкции стенки желудка по малой кривизне на 65% по большой на 94% Эффективность испытуемого соединения при введении в желудок менее выражена и составляет соответственно 39 и 82% (см. табл. 4). Вместе с тем в опытах с язвами желудка, вызванными по методу Шея, соединение I не уменьшает среднего числа поражений слизистой оболочки на одно животное, существенно не уменьшает общее тяжелое послеоперационное состояние животных, не уменьшает число случаев смертельных исходов у подопытных крыс. Таким образом, экспериментальные язвы желудка, вызванные путем полной перевязки привратника, являются менее адекватной моделью для целей экспериментальной фармакотерапии язвенной болезни желудка.

Результаты исследования секреторной функции желудка в условиях острой экспериментальной язвы (см. табл. 5) показывают, что под влиянием соединения I (5 мкг/кг подкожно) кислотность желудочного сока снижается за счет уменьшения содержания свободной хлористоводородной кислоты через 1,5 ч на 42% через 18 ч на 34% Изменения общей кислотности через 1,5 ч были несущественными, а спустя 18 ч после введения испытуемого соединения общая кислотность на 28% ниже по сравнению с состоянием у животных с нелеченой экспериментальной язвой. Протеолитическая активность пепсиногена крови снижается на 25% по сравнению с контрольными животными, тогда как изменений в активности пепсина желудочного сока в тех же условиях опыта не найдено.

Таким образом в опытах с полной перевязкой привратниковой части желудка у белых крыс отчетливо выявляется тормозящее влияние нового ПГ-аналога (I) на кислотообразующую функцию желудка и протеолитическую активность пепсиногена крови. Антисекреторная активность соединения I, обусловленная снижением общей кислотности и уменьшением секреции хлористоводородной кислоты, сохраняется длительное время после однократного введения вещества, тогда как антипепсиногенный эффект через 18 ч не обнаруживается.

Торможение желудочной секреции у крыс в аналогичных условиях опыта достигается при внутривенном введении естественных ПГЕ₁ и ПГА₁ из расчета 1 мкг/кг в 1 мин. Эти же простагландины тормозят секрецию хлористоводородной кислоты у крыс с перевязанным привратником при введении их подкожно в дозе 2,5 мг/кг, что чревато опасностью развития тяжелых побочных эффектов.

Указанные обстоятельства делают естественные простагландины неприемлемыми в качестве противоязвенных средств.

Обращает на себя внимание тот факт, что новый ПГ-аналог обладает чрезвычайно высокой антисекреторной активностью, которая проявляется при введении его однократно подкожно в дозе 5 мкг/кг.

Таким образом очевидно, что высокий противоязвенный эффект соединения I достигается в дозе 5 мкг/кг, тогда как эффективные дозы в эксперименте для антихолинергических средств составляют 25 мг/кг.

Как видно из представленных данных (см. табл. 6), соединение I при введении в дозе 1 мкг/кг внутрибрюшинно не вызывает достоверного изменения скорости продвижения контрастной массы по желудочно-кишечному тракту у белых мышей. При введении изучаемого соединения в дозе 5 мкг/кг отмечается замедление на 27% продвижения содержимого по кишечнику по сравнению с контролем. Однако при введении изучаемого соединения в этой же дозе в желудок существенного влияния на моторно-эвакуаторную функцию кишечника не отмечено. При увеличении дозы соединения I до 50 мкг/кг внутрибрюшинно торможение моторики кишечника не превышает 20%
Влияние нового ПГ-аналога на моторику кишечника изучено также в серии опытов на белых мышах по способности его индуцировать развитие диареи у интактных животных. Данные опытов показали, что соединение I в диапазоне эффективных противоязвенных доз (1-5 мкг/кг) не вызывает поноса у мышей (см. табл. 7).

Установлено, что соединение I в дозах 2,5-5 мкг/кг не влияет на диарею, вызываемую у мышей внутривенным введением серотонина в дозе 5 мг/кг (ЭД₅₀ 3,2 мг/кг). При увеличении дозы испытуемого соединения в 2-4 раза наступает уменьшение выраженности серотониновой диареи на 37-45% по сравнению с контролем (см. табл. 8). Антисеротониновый эффект соединения I в отношении рецепторов кишечника проявляется в диапазоне доз 10-20 мкг/кг. Дальнейшее увеличение дозы соединения I до 50 мкг/кг не ведет к статистически существенному усилению антисеротониновой активности.

Данные опытов свидетельствуют о благоприятном влиянии исследуемого соединения на моторную и секреторную функции кишечника, а также о перспективности и целесообразности испытания его в качестве средства при лечении диареи немикробного происхождения.

Из других эффектов представляет несомненный интерес высокая активность соединения I в отношении проницаемости сосудов. Исследовали влияние соединения I (10^-4-10^-8 М) на проницаемость сосудов брюшной полости у белых мышей, индуцированную уксусной кислотой (0,05% 4 мл). Данные опытов свидетельствуют о том, что исследуемое соединение снижает интенсивность окраски перитонеального экссудата под влиянием синего Эванса, вводимого внутривенно (см. табл. 9). Степень снижения проницаемости сосудов брюшной полости зависит от концентрации испытуемого соединения. Активность проявляется в широком диапазоне концентраций (10^-6-10^-8 М) и достигает 64-68% по сравнению с контролем.

Способность простагландинового вещества стабилизировать мембраны клеток сосудистой стенки имеет существенное значение для нормализации микроциркуляции в сосудах брыжейки желудочно-кишечного тракта, а следовательно, секреции кишечной жидкости и объема содержимого кишечника. Этот эффект соединения I существенно дополняет его противоязвенную активность и расширяет показания для применения вещества при профузных водянистых поносах неинфекционной этиологии.

Соединение I в концентрации 10^-4 М при введении в брюшную полость не вызывает корчей у мышей и, таким образом, в отличие от естественных простагландинов серотонина, гистамина, ацетилхолина раздражающего действия не вызывает и не индуцирует возникновения болевой реакции.

Определение осмотической резистентности эритроцитов [20] в присутствии соединения I (10^-5-10^-8 М) показало, что коэффициент относительно гемолиза эритроцитов практически не изменяется по сравнению с контрольными пробами. Таким образом, простагландиноподобное соединение на устойчивость эритроцитов белых крыс в гипотонической среде существенного влияния не оказывает.

Испытуемое соединение I в концентрации 10^-5 М не оказывает влияния на самый ранний этап свертывания крови агрегацию и адгезивность кровяных пластинок и, следовательно, не может способствовать возникновению тромбов, нарушению микроциркуляции и вызывать микронекрозы.

Соединение I в дозе 50 мкг/кг внутрибрюшинно не оказывает влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и лейкоцитов у белых мышей, определяемую по способности этих иммунных клеток фагоцитировать колибактерии.

Данные острой токсичности соединения I получены при введении белым мышам в вену, под кожу и в мышцу. Симптомы отравления животных ПГ-аналогом сходны при всех испытанных путях введения и выражались в общем угнетении, адинамии, урежении дыхания. Различия наблюдались только в сроках их появления и степени выраженности.

Наиболее быстро развивались симптомы отравления при введении соединения I в вену. Так, сразу после инъекции вещества в дозе 25 мг/кг наступает общее угнетение, заторможенность двигательной активности без признаков наркотизирования. Через 2-3 мин состояние мышей нормализуется. При увеличении дозы соединения I до 27-30 мг/кг наступает гибель соответственно части или почти всех подопытных мышей.

Клиническая картина отравления животных при введении соединения I подкожно и внутримышечно отличается более продолжительным латентным периодом развития симптомов и наступления гибели мышей. После введения соединения I в дозах 55-80 мг/кг угнетение двигательной активности наступает через 10 мин и продолжается в течение 1 ч, затем состояние животных нормализуется.

При увеличении дозы соединения I до 120-160 мг/кг через 10-15 мин после инъекции замедляется дыхание, нарушается двигательная активность, а через 30 мин животное занимает боковое положение. В течение 3 ч непрерывного наблюдения картина отравления остается той же. Гибель животных наступает в течение первых суток после введения соединения I подкожно и на вторые сутки после введения вещества внутримышечно. При увеличении дозы соединения I до 200 мг/кг на фоне общего угнетения отмечаются слабые клонико-тонические судороги, боковое положение и гибель мышей, наступившая в течение первых 5-6 ч наблюдения. Средние смертельные дозы (СД₅₀) при испытанных способах введения приведены в табл.10.

Соединение I по величинам средних смертельных доз является малотоксичным. В опытах на белых мышах оно проявляет такую же токсичность, как антихолинергические средства бензогексоний (СД₅₀ 146 мг/кг), ганглерон (СД₅₀ 145 мг/кг), атропина сульфат (175 мг/кг) и несколько более токсично по сравнению с димекумароном (СД₅₀ 295 мг/кг). Однако оптимальные эффективные дозы этих препаратов в эксперименте равны 25-30 мг/кг, что составляет 20% от СД₅₀ для большинства препаратов и 10% от СД₅₀ лишь для димекумарона. Следовательно, терапевтический индекс (ТИ) бензогексония равен 5,8; ганглерона 4,8; димекумарона 11,8. В то же время ТИ для соединения I в зависимости от пути введения и модели экспериментальной язвы составляет 12900-25800, что делает соединение простагландиновой структуры абсолютно безопасным для организма. Таким образом, токсичность противоязвенных холиноблокирующих средств и ПГ-аналога фактически несопоставима, так как эффективная доза испытуемого вещества составляет лишь 0,008% от СД₅₀.

Известные 16-М-11-дезокси-Е₁ в дозе до 10 мг/кг (0,010 г/кг), которая равна ЕД₅₀, и 16,16-ДМ-11-дезокси-Е₁ в дозе 30 мкг/кг, что составляет ЕД₅₀, ингибируют язвообразование на слизистой желудка. По данным наших опытов, соединение I в дозах 2,5-5 мкг/кг в желудок (в эксперименте в желудок, что равнозначно клиническому орально, эти пути зарубежные авторы отождествляют) тормозит язвообразование на слизистой желудка на 40-81% Графическое определение показывает, что ЕД₅₀соединения I равно 2,5 мкг/кг, ЕД₅₀ 1,5 мкг/кг. Следовательно, соединение I в 4 раза активнее 16-М-11-дезокси-Е₁ и в 20 раз активнее 16, 16-ДМ-11-дезокси-Е₁ при том же пути введения.

Метиловый эфир (±) 7-{2β -[1-амино-3-оксо-4-ацетокси-(1E)-бутенил]-5-оксоциклопентил-1 a } гептановой кислоты формулы

обладающий противоязвенной активностью.

Метиловый эфир (±) 7-{2β -[1-амино-3-оксо-4-ацетокси-(1E)-бутенил]-5-оксоциклопентил-1 a } гептановой кислоты формулы

обладающий противоязвенной активностью.