СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКРИЛАМИДА В ЕГО АДДУКТАХ С БЕЛКАМИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно, экспериментальной и практической токсикологии, и может быть использовано для определения алкилирования белков, в частности гемоглобина, акриламидом в организме экспериментальных животных, подвергающихся воздействию этого ксенобиотика.

Количественная оценка аддуктов алкилирующих ксенобиотиков обычно производится с применением газовой хроматографии и масс-спектрометрии. До сих пор при подготовке проб к анализу предварительно проводился гидролиз алкилированных белков с использованием сильных минеральных кислот либо щелочей, затем следовала стадия изоляции молекулы ксенобиотика, ковалентно связанного с аминокислотами (чаще цистеином). После этого, изолированные соединения подвергались дериватизации для придания им формы летучих эфиров. Потом производилось собственно измерение с применением газовой хроматографии и масс-спектрометрии по стандартной методике [1].

Недостатками этого способа являются невысокая эффективность метода (часть анализируемых компонентов теряется в стадии дериватизации, т.к. отсутствует прямой перенос их в хроматографическую колонку), длительность периода подготовки образцов к измерению (18 ч), необходимость в специальном оборудовании в период подготовки образцов.

Наиболее близким к изобретению техническим решением, избранным в качестве прототипа, является применяемый в настоящее время способ определения акриломида в его аддуктах с белками, использующий газовую хроматографию [1].

Способ осуществляется следующим образом. Экспериментальным животным (крысам) за 24 ч до начала определения вводится водный раствор акриламид в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно. Животным контрольной группы вводится изотонический раствор натрия хлорида в том же объеме. Пробы крови забираются путем сердечной пункции. Глобин выделяется по методу Остермана-Галкарта [2]. Около 5 мг глобина от каждого животного растворяется в 6 М соляной кислоте до концентрации 10 мг/мл. Образцы гидролизируются в течение 18 ч при температуре 110^oC в условиях вакуума. Гидролизаторы выпариваются, а затем растворяются в 1 мл воды и вводятся в колонки Dowex 50 для выделения анализируемого компонента, в данном случае S-(2-каробоксиэтил)1-цистеина. Дериватизация производится по общепринятой методике [3], дальнейшее измерение производится с использованием газовой хроматографии [1].

Однако данный метод имеет следующие недостатки: невысокую эффективность метода (часть анализируемых компонентов теряется в стадии дериватизации, т. к. отсутствует прямой перенос их в хроматографическую колонку), длительность периода подготовки образцов к измерению (18 ч), необходима специальная сепарационная техника для получения S-(2-карбоксиэтил)l-цистеина, этот метод не может быть применен при совместном воздействии акрилонитрила, акриламида и метакрилата, т.к. в результате гидролиза соединений, алкилированных ими, освобождается одно и то же вещество S - - (2-карбоксиэтил)l-цистеин.

Технические и аналитические сложности препятствуют внедрению данного метода в практическую токсикологию и здравоохранение.

Суть предложенного изобретения - упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что количественное определение акриламида в его аддуктах с белками производится следующим образом: окисление до сульфоксида S-атома в цистеине, алкилированном акриламидом, освобождение акриламида из связи с окисленным производным цистеина проводилось высокотемпературным нагреванием при 300^oC в инжекторе газового хроматографа и далее акриламид прямо переносится в колонку потоком газовой фазы, сразу идет его количественное определение.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что в заявляемом способе в отличие от известного производится окисление атома серы в алкилированном цистеине до сульфоксида с помощью перекиси водорода, что позволяет в дальнейшем отделить исходную молекулу акриламида. Таким образом, заявляемый способ соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ определения акриламида в его аддуктах с белками осуществляют следующим образом. В качестве экспериментальных животных использовались крысы самцы линии Вистар массой 350 - 400 г. Животные имели свободный доступ к воде и пище в течение всего эксперимента. Водные растворы акриламида вводились внутрибрюшинно объемом 1 мг/л массы тела в диапазон от 5 до 75 мг/кг акриламида однократно. Контрольным животным вводился равный объем изотонического раствора натрия хлорида. Количество животных каждой группы равнялось 3 - 8. Под нембулатовым наркозом пробы крови по 5 мл были взяты путем сердечной пункции через 24 ч после последней инъекции акриламида.

Очищение глобина производилось по методу Остермана-Голкара [2]. Затем производили окисление атома серы в алкилированном глобине до образования сульфоксидной формы. Инкубационная смесь общим объемом 0,5 мл включала 0,25 мл (водного раствора N-ацетил-S-акриламида-1 цистеина или глобина (10 мг), или белков плазмы (10 мг) и 0,25 мл 3%-ной перекиси водорода (для окисления атома серы в цестеине глобина).

Эта смесь инкубировалась при 30^oC в течение 30 мин при энергичном встряхивании. Реакция останавливалась после разрушения перекиси водорода путем добавления каталазы (484 ЕД). Потом по 2 мкл полученных образцов вводились сплит-методом в инъекционную камеру газового хроматографа, где при температуре 300^oC происходило освобождение исходного (акриламида) из соединения с окисленными продуктами и следовал прямой перенос в колонку акриламида в составе газовой фазы. Примерная схема способа показана на чертеже. Результаты определений приведены в таблице.

Таблица. Взаимосвязь между кумулятивной дозой акриламида и содержанием его в аддуктах с гемоглобином (Hb) и белками плазмы крыс при подостром внутрибрюшинном введении взрослым крысам-самцам.

В каждой серии 3 - 8 животных.

Аналитические доказательства, базирующиеся на капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрометрии, подтверждают идентичность хроматографического пика вещества, присоединенного к белку - акриламида, определяющуюся одинаковыми временем удержания и выходом из колонки, а также ионным спектром, совпадающим со спектром стандарта акриламида. У животных контрольной группы, не подвергавшихся воздействию акриламида, его аддуктов с гемоглобином обнаружено не было.

В эксперименте исследовались пробы крови, взятые у 27 экспериментальных животных.

Использование предлагаемого способа определения акриламида в его аддуктах с белками обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества.

Этот способ более чувствительный, чем прототип. Выход акриламида составлял 87% при анализе N-ацетил-S(2-акриламид)-l-цистеина. Количество акриламида, освобождаемого из белковых аддуктов пропорционально кумулятивной дозе акриламида, вводимого в диапазоне 5 - 75 мг/кг в течение 1 - 3 нед.

Исключается принципиальная потеря анализируемых компонентов в стадии дериватизации, т.к. имеется прямой перенос акриламида из окисленных аддуктов в хроматографическую колонку.

Период подготовки образцов значительно сокращается (30 мин вместо 18 ч).

Отсутствует необходимость в специальной сепарационной технике для получения S-(2-карбоксиэтил)l-цистеина.

Этот способ сравнительно недорогой, т.к. основной реагент - перекись водорода является обычным аптечным коммерческим продуктом.

Появляется возможность дифференцированного определения акриламида при комбинированном воздействии с другими акриловыми соединениями в аддуктах с белками.

Источники информации.

1. Bailely E., Farmer P., Bird I et al. Monitoring exposure to acrylamide by the determination of S-(2-carboxyethyl)cysteine in hydrolyzed hemoglobin by gas chromatography-mass spectrometry. Analyt Biochem., 1986, vol. 157, p. 241-248.

2. Osterman-Golkar S., Ehrenberg L., Segerback D., 1. Evaluation of genetic risks of alkyating agents. 2. Haemoglobin as a dose monitor., Mutat. Res., 1976, vol. 34, p. 1-10.

Назначение: медицина, экспериментальная токсикология, для определения алкилирования белков акриламидом в организме. Сущность: берут пробу крови, очищают глобин по Остерману-Голкару, подготавливают образец окислением атома серы в тиоэфире акриламида с последующим освобождением акриламида из связи с окисленным производным цистеина при температуре 300^oC в инжекторе газового хроматографа, переносят акриламид в хроматографическую колонку с потоком газовой фазы для последующего количественного определения. 1 табл., 1 ил.

Способ определения акриламида в его аддуктах с белками крови, включающий взятие крови, очищение глобина по Остерману-Голкару, подготовку образцов к определению, количественное определение акриламида с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрий, отличающийся тем, что подготовку образцов к количественному определению осуществляют путем окисления атома серы в алкилированных белках до сульфоксидной формы с помощью перекиси водорода с последующим освобождением акриламида из сульфоксидной формы при температуре 300^oС в инъекционной камере газового хроматографа.