СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСТРОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для прогнозирования течения инфаркта миокарда.

Индикаторные тесты, основанные на высокой реактивности нейтрофила, широко используются в клинической медицине и по чувствительности нередко превосходят другие лабораторные показатели. Высокая скорость обмена нейтрофилов крови придает таким исследованиям особую информативность, позволяя прицельно наблюдать за динамикой патологического процесса.

Известны методы диагностики различных форм ИБС с помощью изучения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов: полярография (Klebanoff S.J. Clark R.X. 1978), восстановление цитохрома C (Ozahi J. at al. 1986), восстановление нитросинего тетразолия (Маянский А.Н. Галиуллин А.Н. 1984), прямая хемилюминесценция (Маянский А.Н. и др. 1987) и другие.

Для получения критериев дифференциальной диагностики ранних, поздних рецидивов инфаркта миокарда, а также прогнозирования и оценки тяжести течения рецидивов инфаркта миокарда используют цитохимические (щелочная фосфата, миелопероксидаза) и морфометрические (площадь клеток и их ядер) показатели нейтрофилов (Гмурман В.У. 1972 и др; Лецков В.Б. 1978; Qracham J, 1964), а также показатели фагоцитарной активности (Маянский А.Н. Маянский Д.Н. 1989).

Однако указанные методы не позволяют судить о состоянии рецепторного аппарата полиморфно-ядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), т.е. о степени десенситизации, коррелирующей с тяжестью повреждения этих клеток.

Наиболее близким техническим решением предлагаемого способа является определение состояния рецепторного аппарата нейтрофилов у больных инфарктом миокарда, основанного на методике определения гетерогенности рецепторного аппарата ПМЯЛ крови (Клебанов Г.И. и др. 1987). Авторы выделяли ПМЯЛ из периферической крови здоровых лиц, больных хроническими формами ишемической болезни сердца (ИБС) и инфарктом миокарда с последующей их окраской иммунными комплексами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), что позволяло им по изменению интенсивности флюоресценции суспензии нейтрофилов оценивать их лигаид-связывающую способность.

Однако существенным недостатком этого метода является учет интенсивности флюоресценции всего объема исследуемой суспензии ПМЯЛ, т.е. клеток и среды, в которой они находятся, а не самих нейтрофилов в чистом виде, так как фоновое свечение могут давать оставшиеся обломки оболочек эритроцитов после их гемолиза и другие возможные артефакты. В связи с этим, данный метод не позволяет судить непосредственно об экспрессии рецепторов (Fc рецепторов), а тем более об их функциональной активности, что в конечном итоге приводит к понижению точной диагностики.

Данные недостатки устраняются тем, что ведется подсчет интенсивности флюоресценции (lum • 10^-3) единичной клетки и из этого значения вычитают свечение фона (свободного от нейтрофила участка), а также тем, что среди исследуемых клеток выделяют морфологические типы свечения мембран (кепы, пэтчи, ринги), что дает возможность более точно судить об активности рецепторного аппарата нейтрофилов и функционально связанных с ним метаболических процессов в клетке и на ее поверхности.

Способ заключается в следующем.

1.Выделение нейтрофилов на грациенте плотности верографин-фиколла.

2. Инкубация выделенных клеток с люминесцентными конъюгатами кроличьих иммуноглобулинов.

3. Подсчет интенсивности свечения (lum • 10^-3) трех морфологических типов свечения мембран (условные единицы).

Изобретение направлено на решение задач прогнозирования течения инфаркта миокарда, поэтому забор крови у больного осуществляется на 1,7,14,21 сутки от начала заболевания.

Способ осуществляется следующим образом.

Из венозной крови в количестве 5-10 мл выделяют нейтрофилы на градиенте плотности верографин-фиколла. Для этого кровь, отобранную с Na-солью этилендиаминтетрауксусной кислоты, разводят в 4 раза 0,9%-ным раствором NaCl и наслаивают на раствор верографин-фиколла (d 1,077-1,078 г/см³ по 7 мл в каждую пробирку и центрифугируют 40 мин при 400 q. После центрифугирования образуется осадок эритроцитов и гранулоцитов. Нейтрофилы располагаются пленкой на поверхности осадка.

Для получения взвеси гранулоцитов удаляют верофиколл, а осадок, содержащий эритроциты и гранулоциты, разводят в 1 мл физиологического раствора. Содержимое пробирок объединяют и переносят в силиконированные пробирки, где осаждают эритроциты 10%-ным раствором желатина (конечная концентрация желатина 1%). В течение 45-60 мин при 37^oC эритроциты лизируют 0,83%-ным раствором NH₄Cl. После перемешивания осадка фракции, содержащей гранулоциты с десятикратным объемом раствора NH₄Cl, центрифугируют ее 5-10 мин при 400q. Процедуру повторяют несколько раз до полного освобождения гранулоцитов от эритроцитов. Проверяют жизнеспособность клеток по трипановому синему и подсчитывают в камере Горяева.

Выделенные клетки доводят до рабочей концентрации 2,0-2,5•10⁶кл/мл и инкубируют с люминесцентными коньюгатами кроличьих иммуноглобинов против иммуноглобулинов человека в течение 15 мин при 37^oC. Отмывают двукратно в среде 199 и делают препараты, которые просматривают с помощью люминесцентного микроскопа ЛМ-И2 с использованием объектива •60 (водная иммерсия) и окуляра • 8.

Подсчитывают на мазке 50 нейтрофилов и среди них выделяют следующие морфологические варианты или типы свечения: ринг (ring) кольцо флюоресценции, видимое в ультрафиолетовом свете, демонстрируют равномерность распределения меченых комплексов на клеточной поверхности, пэтч (patch) нарушается равномерность свечения клеточной поверхности, образуется разрывы кольца с появлением зон с усиленным или ослабленным свечением; кэп (cap) или шапочка процесс перераспределения в плоскости мембраны заканчивается объединением мелких комплексов в массивный агрегат, который принято называть колпачком.

Из перечисленных трех морфологических форм выбирают для анализа только клетки с кэпами как наиболее демонстративные по типу свечения мембраны.

Интенсивность свечения выбранных клеток измеряют в условных единицах, показания снимаются с фотоэлектронного умножителя, установленного на микроскопе.

Подсчитывают интенсивность свечения каждой клетки следующим образом: регистрируют показания ФУ единичной клетки и вычитают из него значение интенсивности свечения фона участка "чистого поля", расположенного рядом с этой клеткой.

Рассчитывают среднее арифметическое значение интенсивности свечения анализируемых клеток. Забор крови у больных острым инфарктом миокарда осуществляется на 1,7,14,21 сутки от начала заболевания. В том случае, если величина рассчитываемого показателя изменяется в сторону увеличения относительно первого дня заболевания и приближается на 21 сутки течения заболевания к показателям здоровых лиц (0,015-0,020 усл.ед.) можно говорить о благоприятном течении инфаркта миокарда. Если же значения интенсивности свечения кепов не изменяются и остаются такими же как в первые сутки развития заболевания, можно ожидать осложненное течение заболевания и возрастает вероятность развития рецидива.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие его критерию "новизна".

При изучении других известных технических решений в данной области технические признаки, отличающие заявляемый способ от прототипа, не были выявлены и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию "существенные отличия".

По предлагаемому способу было обследовано 72 больных острым инфарктом миокарда. В этой группе у 64 больных был трансмуральный инфаркт миокарда, у 8 нетрансмуральный. Мужчин было 56 человек, женщин 16 в возрасте от 40 до 68 лет.

У 45 больных был первичный инфаркт миокарда, у остальных повторный. У 36 больных инфаркт миокарда локализовался в области передней стенки левого желудочка, у 29 в области задней стенки левого желудочка. В 76% случаев инфаркт протекал с различными осложнениями. Чаще сочетался с отеком легких, реже отмечались нарушения сердечного ритма. У женщин чаще, чем у мужчин, наблюдалось сочетание различных видов осложнений. Кардиогенный шок имел место у 16 больных.

Диагноз основывался на жалобах пациента, данных клинического наблюдения, характерных изменений на ЭКГ (наличие патологического зубца Q или комплекса QS) и подъема активности ферментов: креатининфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

В качестве клинических критериев осложненного течения острого инфаркта учитывались: развитие рецидива острого инфаркта миокарда, острые нарушения ритма сердца, острая левожелудочковая недостаточность с сердечной астмой или отеком легких.

В исследования не включали больных старше 68 лет, лиц, имеющих выраженные аллергические состояния и заболевания, сопровождающиеся высокой температурной реакцией. Летальный исход составил 13%
В результате проведенных исследований нами было получены количественные критерии, характеризующие структурную и функциональную организацию рецепторного аппарата нейтрофилов, которые позволяли разделить всех больных инфарктом миокарда на две группы с осложненным течением заболевания и без осложнений) (см. таблицу).

Ранее (1992) нами была изучена структурная и функциональная организация рецепторного аппарата нейтрофилов у здоровых лиц. Показатели интенсивности свечения кэпов здоровых лиц всегда были выше 0,014 усл.ед. Результаты исследований у больных острым инфарктом миокарда показали возможность использования полученных количественных критериев с целью прогноза течения инфаркта миокарда. В случае увеличения интенсивности свечения кэпов к 21 дню заболевания, можно говорить о благоприятном исходе заболевания. И, наоборот, отсутствие изменений интенсивности свечения кэпов дает возможность прогнозирования поздних рецидивов и расценивается как неблагоприятный прогностический тест.

Динамическое исследование уровня этих критериев приобретает важное значение, особенно в тех случаях, когда по клиническим признакам и данным ЭКГ трудно установить наличие повреждения миокарда и следить за развитием или стабилизацией некроза. Способ повышает точность диагностики инфаркта миокарда, что, в свою очередь, позволяет предупредить возможные осложнения и летальные исходы на госпитальном этапе ведения больных.

Использование: в медицине, а именно в кардиологии и иммунологии, и предназначено для прогнозирования течения острого инфаркта миокарда. Сущность изобретения: исследуют нейтрофилы, в которых определяют интенсивность свечения кэпов мембран клеток в динамике (1, 7, 14, 21 сутки), сопоставляют их с показателями здоровых лиц (0,015 - 0,020 усл.ед.) и при увеличении свечения кэпов к 21 дню заболевания выше 0,009 усл.ед. и приближении к показателям здоровых лиц прогнозируют благоприятное течение инфаркта миокарда, при отсутствии изменений свечения относительно первого дня - ухудшение течения заболевания и возможность развития рецидива. 1 табл.

Способ прогнозирования течения острого инфаркта миокарда путем излучения функционального состояния полиморфно-ядерных лейкоцитов крови, отличающийся тем, что иммунофлюоресцентным методом исследуют рецепторный аппарат нейтрофилов, в которых определяют интенсивность свечения "кепов", мембран клеток в динамике (1, 7, 14, 21 сутки) сопоставляют их с показателями здоровых лиц (0,015-0,020 усл.ед.) и при увеличении свечения "кепов" к 21 дню заболевания выше 0,009 усл. ед. и приближении к показателям здоровых лиц прогнозируют благоприятное течение инфаркта миокарда, при отсутствии изменений свечения относительно первого дня ухудшение течения заболевания и возможности развития рецидива.