СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У ПАЦИЕНТА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и клинико-лабораторной диагностике и может быть использовано для установления степени тяжести патологического процесса прогнозирования его течения и для оценки корригирующей терапии.

Известен способ оценки продукции окиси азота по сосудодвигательной функции эндотелия, основанный на измерении диаметра сосуда и кровоток по нему при коронарографии во время действия эндотелийзависимого стимула (проба с ацетилхолином или психоэмоциональный стресс). (Yeung A.C. Vekshtein V.I., Krantz D. S. et al. The effect of atherosclerosis on the vasomotor response of coronary arteries to mentai stress. N Engl J Med 1991; 325: 1551-1556.)
Недостатком данного способа является то, что коронарографическое исследование - инвазивный, достаточно дорогостоящий, не всегда доступный способ и его нельзя применять для наблюдения за изменениями функции эндотелия, кроме того, оценка продукции окиси азота в данном случае может быть произведена только косвенным путем.

Известны также неинвазивные способы оценки функции эндотелия: ультразвуковой, основанный на измерении диаметра сосуда (Celermajer D.S., Sorensen К.Е., Gooch V.M. et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet 1992; 340: 1111-1115. ) или способ веноокклюзионной плетизмографии, определяющий величину кровотока в периферических артериях (Panza J.A., Quyyumi A.A., Brush J.E., Epstein S. E. Abnormal endotheliium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N Engl J Med 1990; 323: 22-27.)
Недостатком этих способов является то, что они отражают эндотелиальную функцию крупных сосудов и их сосудодвигательную реакцию, являющуюся суммой взаимодействия эффектов различных вазоактивных веществ в определенный короткий период времени и только косвенно могут оценивать выработку окиси азота в организме.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения нитратов и нитритов в биологических субстратах с малым их содержанием (кровь, сыворотка крови, молоко и др.), называемый фотометрическим, с применением кадмиевой колонки (Московская ордена Трудового Красного Знамени Ветеринарная Академия имени К.И. Скрябина. Малахов А.Г., Моисеева К.Ф., Фролов Л.А. Методы определения нитратов и нитритов в биологических субстратах. Методические указания. Москва 1990). Способ основан на взятии пробы, ее подготовке в следующем порядке: экстракция проб горячей дистиллированной водой, осаждение белков реактивом, смесью веществ сульфата цинка и гидроксида бария или сульфата цинка и гидроксида натрия. Производят построение калибровочного графика зависимости оптической плотности от концентрации нитритов в наборе эталонных растворов различных концентраций. Затем переводят восстановлением нитратов в нитриты исследуемой пробы с помощью регента - кадмия, находящегося в кадмиевой колонке. Для определения оптической плотности пробы окрашивают реактивом Грисса. Затем определяют оптическую плотность пробы фотометрическим измерением при длине волны 540 нм. Сопоставление оптических плотностей исследуемой и эталонной проб по калибровочному графику дает определение искомой концентрации нитратов и нитритов исследуемой пробы. Восстановительную способность реагента обеспечивают замачиванием в 0,1 М растворе соляной кислоты в течение нескольких часов и последующем промыванием в дистиллированной воде.

Недостаток данного способа заключается в его трудоемкости и длительности, так как скорость прохождения раствора через кадмиевую колонку невысока, что весьма значимо при серийном производстве анализов.

Задачей изобретения является повышение информативности способа, повышение точности диагностики и эффективности способа.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе, включающем взятие пробы, обработку ее для осаждения белков реактивом, включающем сульфат цинка, построение калибровочного графика зависимости оптической плотности от концентрации нитритов в наборе эталонных растворов различных концентраций, перевод восстановлением нитратов в нитриты в исследуемой пробе реагентом, содержащим кадмий, определение оптической плотности исследуемой пробы, окрашенной по Гриссу, сопоставление оптических плотностей исследуемой и эталонной проб по калибровочному графику с определением искомой метаболитов окиси азота исследуемой пробы, обеспечение восстановительной способности реагента промыванием 0,1 М раствором соляной кислоты, до взятия проб готовят пациента исключением поступления в организм нитратов экзогенного характера назначением нитратоисключающих диеты и терапии на 2-3 суток, перевод нитратов в нитриты осуществляют набором реактивов нитрат редуктора, включающего медь.

Кроме того, в случае определения окиси азота в крови взятие пробы крови осуществляют в присутствии гепарина, центрифугируют для получения плазмы, осаждают в ней белки сульфатом цинка, центрифугируют полученную смесь, отбирают жидкую часть.

Кроме того, для повышения точности и сокращения сроков проведения анализа промывание осуществляют последовательно 0,1 М раствором соляной кислоты - дистиллированной водой - 1% раствором сульфата меди - дистиллированной водой, причем в течение 10 секунд в каждом активном растворе.

Способ осуществляют следующим образом. За 3 дня до исследования пациенту назначают диету с исключением продуктов, содержащих большое количество экзогенных нитратов (копченые продукты, колбасные изделия, овощи, продукты, содержащие консерванты). Забор крови осуществляют в количестве 4 мл из кубитальной вены в коническую пробирку, содержащую гепарин. Затем кровь центрифугируют при 3000 оборотах 15 минут при комнатной температуре. Полученную плазму переносят в другую пробирку и добавляют для осаждения белков 30% раствор сульфата цинка в количестве 1/20 объема плазмы и хорошо перемешивают. Затем вновь центрифугируют при 3000 оборотах в течение 15 минут. Жидкую часть пробы переносят в чистую пробирку. Пробы мочи забирают из ее суточного количества в количестве не менее 1 мл. Возможно хранение проб в замороженном виде при температуре не выше -18^oC. По значениям концентраций водных растворов нитрита натрия (5, 10, 20, 30, 40, 50 мкмоль) и по данным оптической плотности этих окрашенных растворов в результате взаимодействия с реактивом Грисса, полученных при спектрофотометрии с длиной волны 540 нм, производят построение калибровочного графика для последующего определения концентрации нитратов/нитритов в опытных растворах. Если пробы были заморожены, то их размораживают при комнатной температуре. Дальнейшая подготовка и ход определения нитратов/нитритов в моче и плазме не различаются. Перевод нитратов в нитриты осуществляется с помощью реактивов Niralyzer (Nitrate reductor), состоящего из реактора и пробирки. Его подготовка к работе заключается в последовательной промывке его в растворе 0,1 М HCl не более 10 с сполоскивании в дистиллированной воде, затем в 1% растворе CuSO₄ и повторной промывке в дистилированной воде. В пробирку реактора вносят 720 мкл исследуемого раствора и добавляют 80 мкл 0,5 М аммонийного буфера с pH 9, приготовляемого из NH₄OH (соотношение пробы и буфера 1:9). В пробирку помещают реактор и выдерживают 5 мин (время, необходимое для реакции) при постоянном встряхивании. Затем извлекают реактор и берут из пробирки 500 мкл пробы и смешивают в отдельной пробирке с 500 мкл 0,6% реактива Грисса. Экспонируют 10 минут. Определение оптической плотности раствора производят на спектрофотометре при длине волны 540 нм с контролем, содержащим дистиллированную воду и 0,6% реактив Грисса в соотношении 1:1. Концентрацию нитратов/нитритов определяют путем сопоставления полученного значения оптической плотности с калибровочным графиком.

В затрудненных случаях клинической диагностики заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией, а также когда необходимо знать составные части уровня окиси азота в организме, соответствующие различным условиям внешней среды, и ответной реакцией организма на них и влияющие на уровень оксида азота, например в условиях покоя и в экстремальных условиях, заявляемый способ дополняется операцией проведения гипоксического теста, дающего исчерпывающую характеристику изменения эндотелиальной функции в условиях стресса. Если после гипоксического теста полученные значения остались низкими и не отличаются от исходных значений, можно сделать вывод о наличии эндотелиальной дисфункции у пациента.

Примеры.

1. Больной Ш., 32 лет, диагноз: гипертоническая болезнь II стадии. Длительность заболевания 6 лет. Субъективно повышение АД не ощущал. При осмотре глазного дна выявлена гипертоническая ангиопатия сетчатки, по данным допплерэхокардиографии - умеренная гипертрофия левого желудочка. По результатам суточного мониторирования АД усредненное значение систолического АД составило 156 мм рт. ст., вариабельность 18,2, а для диастолического АД усредненное значение 90 мм рт.ст. и вариабельность - 11,8. Концентрация нитритов и нитратов в суточной моче была 25,67 мкмоль/дл и суточная экскреция 22,84 мкмоль/сут, а в плазме 4,39 мкмоль/дл. Тогда как у здоровых концентрации нитритов и нитратов в суточной моче была 64,40 мкмоль/дл и суточная экскреция 51,52 мкмоль/сут, а в плазме 6,59 мкмоль/дл. Таким образом, у большого были выявлены значительные нарушения эндотелиальной функции.

2. Больной М., 23 лет, диагноз: гипертоническая болезнь I стадии. Предъявлял жалобы на головные боли, головокружение. Периодически после физической нагрузки отмечались повышения артериального давления до 145 и 90 мм рт.ст. Поражения органов мишеней не выявлено. Показатели суточного мониторирования АД были следующими: усредненное значение систолического АД 125 мм рт.ст., вариабельность 11,04, а для диастолического АД усредненное значение 87 мм рт. ст. и вариабельность 8,39. Концентрация нитритов и нитратов в суточной моче составляла 53,26 мкмоль и суточная экскреция 64,87 мкмоль/сут. Таким образом, клинико-лабораторные данные не были однозначными, а показатели нитратов и нитритов были близки к таковым у здоровых лиц. Больному был проведен гипоксический тест: 10-ти минутное вдыхание воздушной смеси с регулируемой концентрацией кислорода, под контролем его содержания в крови и показателей гемодинамики. После проведения гипоксического теста показатели нитратов и нитритов в моче возросли незначительно и не достигли уровня у здоровых лиц. Был сделан вывод о нарушенной эндотелиальной функции у данного пациента, рекомендован прием небольших доз эналаприла. По аналогии с вышеперечисленными примерами в клинике Саратовского НИИ кардиологии были обследованы 38 больных гипертонической болезнью у которых был выявлен низкий уровень нитратов и нитритов в моче, что свидетельствовало о нарушенной эндотелиальной функции.

Изобретение относится к области медицины и клинико-лабораторной диагностике и может быть использовано для установления степени тяжести патологического процесса, прогнозирования его течения и для оценки корригирующей терапии. Сущность изобретения заключается в том, что в способе, включающем взятие пробы, обработку ее для осаждения белков реактивом, включающем сульфат цинка, построение калибровочного графика зависимости оптической плотности от концентрации нитритов в наборе эталонных растворов различных концентраций, перевод восстановлением нитратов в нитриты в исследуемой пробе реагентом, содержащим кадмий, определение оптической плотности исследуемой пробы, окрашенной по Гриссу, сопоставление оптических плотностей исследуемой и эталонной проб по калибровочному графику с определением искомой метаболитов окиси азота исследуемой пробы, обеспечение восстановительной способности реагента промыванием 0,1 М раствором соляной кислоты, до взятия проб готовят пациента исключением поступления в организм нитратов экзогенного характера назначением нитратоисключающих диеты и терапии на 2-3 суток, перевод нитратов в нитриты осуществляют набором реактивов нитрат редуктора, включающего медь. Кроме того, в случае определения окиси азота в пробе крови взятие пробы осуществляют в присутствии гепарина, а обработку пробы осуществляют центрифугириванием до получения плазмы, осаждают в ней белки сульфатом цинка, повторно центрифугируют полученную смесь и отбирают жидкую часть. Кроме того, для повышения точности и сокращения сроков проведения анализа промывание осуществляют последовательно 0,1 М раствором соляной кислоты - дистиллированной водой - 1%-ным pаствopoм сульфата меди - дистиллированной водой, причем в течение 10 с в каждом активном растворе. Способ обеспечивает неинвазивность, повышение эффективности и точности диагностики. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ оценки состояния эндотелиальной функции у пациента, отличающийся тем, что до взятия проб биологической жидкости у пациента исключают поступление в организм нитратов экзогенного характера путем назначения нитратисключающей диеты и терапии в течение 2 - 3 суток, затем определяют уровень нитратов /нитритов в суточной моче и плазме крови путем осаждения белков сульфатом цинка, перевода нитратов в нитриты набором реактивов нитрат редуктора, включающего медь, промывания реагента, определения оптической плотности исследуемой пробы, окрашенной по Гриссу при 540 нм, и определения исследуемых веществ по калибровочной кривой и при уменьшении определенного уровня нитратов и нитритов в моче и плазме крови относительно нормы оценивают нарушение эндотелиальной функции. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно после определения исходного уровня концентрации нитратов и нитритов, пациенту проводят гипоксический тест, повторно определяют уровень нитратов и нитритов, производят сравнение полученных данных до и после гипоксического теста, а также с нормой у здоровых лиц и при уменьшении уровня нитратов и нитритов в моче и в плазме относительно нормы оценивают нарушение эндотелиальной функции. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание реагента осуществляют последовательно: 0,1 М раствором соляной кислоты дистиллированной водой, затем 1%-ным раствором сульфата меди - дистиллированной водой, причем в течение 10 с в каждом активном растворе. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что взятие пробы крови осуществляют в присутствии гепарина, а обработку пробы осуществляют центрифугированием до получения плазмы, осаждают в ней белки сульфатом цинка, повторно центрифугируют полученную смесь и отбирают жидкую часть.