СОЛИ 5'-Н-ФОСФОНАТА 3'- АЗИДО-3'-ДЕЗОКСИТИМИДИНА, ЯВЛЯЮЩИЕСЯ СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ИНГИБИТОРАМИ ПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ВИЧ-1 И ВИЧ-2 Российский патент 1998 года по МПК C07H19/73 A61K31/70 

Изобретение относится к вирусологии и касается новых биологически активных соединений, а именно 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы:

где R - атом щелочного или щелочноземельного металла.

Новые соединения обладают способностью специфически ингибировать продукцию вируса иммунодефицита человека, что позволяет предполагать возможность их использования в медицине для лечения СПИД.

В настоящее время известны различные соединения, ингибирующие продукцию вируса иммунодефицита человека. Наибольшее распространение из них получил 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ) [1].

Известны также 5'-фосфонаты 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов [2], в том числе 5'-H-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина, которые обладают ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2, но при этом менее токсичны, чем АЗТ. Однако создание лекарственной формы на основе 5'- фосфонатов 3'-азидо-2', 3'-дидезоксинуклеозидов крайне затруднено из-за их высокой гигроскопичности.

Заявляемые соли 5'-H-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина по активности и токсичности не уступают кислотной форме 5'-H-фосфоната 3'-азидо-З'-дезокситимидина, но в тоже время им присуща существенно меньшая гигроскопичность. Кроме того, новые соли расширяют круг соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Новые вещества представляют собой белые кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде, ограниченно растворимые в спиртах, хлороформе и хлористом метилене.

Их получение проводят нейтрализацией 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина гидратами окисей соответствующих металлов в воде до pH 7-7,2. Образующиеся растворимые соли упаривают до малых объемов, из которых начинается самопроизвольная кристаллизация и оставляют при 4^oC на 5-6 ч до окончания кристаллизации, выпавшие осадки отфильтровывают, промывают малыми объемами охлажденной до 4^oC воды и сушат. Выход целевых веществ составляет 95-98%.

Чистота и структура новых соединений подтверждены данными ВЭЖХ и УФ- и ЯМР-спектроскопии.

Ниже приводятся примеры получения конкретных солей 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

Пример 1. Синтез натриевой соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина
К раствору 166 г (0,5 молей) 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моля) 5н. раствора гидрата окиси натрия (квалификации хч) до pH среды 7,2. Образовавшийся прозрачный белый раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oC С до 150-170 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oC. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oC дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход 164 г (95,4%), т. пл. > 300^oC (обугливание). Вещество малогигроскопично.

Время удерживания на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте KH₂PO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода) λ_max 266 нм ( ε 9600), 1Н ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 1,93 д (3H, CH₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2H, H2'); 4,60-3,95 м (4H, H3' + H4' + 2H5'); 6,15 т (1H, H1', J_H1'H2' 6 Гц); 7,66 д (1H,H6, J_H6,CH3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 6,5 д (1H, H^P, J_H,P 626 Гц; J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 2. Синтез калиевой соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 166 г (0,5 молей) 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моля) 5н. раствора гидрата окиси калия (квалификации хч) до pH среды 7,2. Образовавшийся прозрачный белый раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oC до 150-170 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oC. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oC дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход 172 г (97,1%), т.пл. > 300^oC (обугливание). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте KH₂PO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода) λ_max 266 нм ( ε 9600), 1H ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 1,93 д (3H, CH₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2H,H2'); 4,60-3,95 м (4H, H3'+H4'+2H5'); 6,15 т (1H, H1', J_H1'H2' 6 Гц); 7,66 д (1H,H6, J_H6,CH3 1 Гц). ³¹P-ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 6,5 д (1H,H^P, J_H,P 626 Гц; J_P-5H' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 3. Синтез кальциевой соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 166 г (0,5 молей) 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 1000 мл (0,25 моля) 0,5н. предварительно профильтрованного раствора гидрата окиси кальция (квалификации хч) до pH среды 7,0. Образовавшийся прозрачный белый раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oC до примерно 200 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oC. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oC дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход 174 г (97,1%), т.пл. > 300^oC (обугливание). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте KH₂PO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода) λ_max 266 нм ( ε 9600), 1H ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 1,93 д (3H, CH₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2H,H2'); 4,60-3,95 м (4H, H3'+H4'+2H5'); 6,15 т (1H, H1', J_H1'H2' 6 Гц); 7,66 д (1H,H6, J_H6,CH3 1 Гц). ³¹P-ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 6,5 д (1H,H^P, J_H,P 626 Гц; J_P-5H' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц). Пример 4. Синтез бариевой соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 166 г (0,5 молей) 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 1000 мл (0,25 моля) 0,5 н. предварительно профильтрованного раствора гидрата окиси бария (квалификации хч) до pH среды 7,0. Образовавшийся прозрачный белый раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oC до примерно 3300 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 48^oC. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oC дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход 226 г (98,5%), т.пл. > 300^oC (обугливание). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте KH₂PO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода) λ_max 266 нм ( ε 9600), 1H ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 1,93 д (3H, CH₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2H,H2'); 4,60-3,95 м (4H, H3'+H4'+2H5'); 6,15 т (1H, H1', J_H1'H2' 6 Гц); 7,66 д (1H,H6, J_H6,CH3 1 Гц). ³¹P-ЯМР-спектр (D₂O, δ ), м.д.: 6,5 д (1H,H^P, J_H,P 626 Гц; J_P-5H' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Brucker 250 МГц. Спектры УФ определяли на спектрофотометре Specord UV-vis М-40. ВЭЖХ осуществляли с использованием колонки Nucleosil 120-7 NH₂.

Были изучены биологические свойства новых соединений, а именно их способность специфически ингибировать продукцию вируса иммунодефицита человека и токсичность. Исследования проводили на культурах лимфоцитов человека- перевиваемых лимфобластоидных линиях клеток человека H9/IIIВ, МТ-4 и PBL. Продукция вируса клетками контролировалась в реакциях непрямой иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа. Активность соединений характеризовали с помощью величины ЭД-эффективной концентрации, подавляющей продукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на 50%, токсичность - с помощью величины ТД-концентрации, подавляющей рост клеток на 50%. Индекс селективности вычисляли как отношение ТД к ЭД. Для сравнения использовали кислотную форму 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Данные экспериментов приведены в табл. 1-3.

Таким образом новые вещества- соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина -ингибируют размножение ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культурах лимфоцитов человека H9, МТ-4 и PBL, причем примерно с той же активностью, с которой это наблюдалось и для кислотной формы 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Токсичность заявляемых солей 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина также находится в пределах токсичности кислотной формы 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. В то же время новые соединения являются мало- или негигроскопичными, что облегчает создание лекарственных форм на их основе.

Изобретение относится к вирусологии и касается новых биологически активных соединений, а именно солей 5'Н-фосфоната 3'-азидо-3'- диокситимидина общей формулы, приведенной в описании. Новые соединения обладают способностью специфически ингибировать продукцию вируса иммунодефицита человека, что позволяет предполагать возможность их использования в медицине для лечения СПИД. Их получение проводят нейтрализацией 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3' дезокситимидина гидратами окисей соответствующих металлов в воде до рН 7 - 7,2. Образующиеся растворимые соли упаривают до малых объемов, из которых начинается самопроизвольная кристаллизация и оставляют при 4^oС на 5 - 6 ч до окончания кристаллизации, выпавшие осадки отфильтровывают, промывают малыми объемами охлажденноц до 4^oС воды и сушат. Выход целевых веществ составляет 95 - 98%. Новые соединения ингибируют размножение ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культурах лимфоцитов человека Н9, МТ-4 и PBL и являются мало- или негигроскопичными, что облегчает создание лекарственных форм на их основе. 3 табл.

Соли 5'-H-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы:

где R - атом щелочного или щелочноземельного металла, являющиеся специфическими ингибиторами продукции вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2.