ЗАМЕЩЕННЫЕ АММОНИЕВЫЕ СОЛИ 5'-Н-ФОСФОНАТА 3'-АЗИДО-3'-ДЕЗОКСИТИМИДИНА, ЯВЛЯЮЩИЕСЯ СЕЛЕКТИВНЫМИ ИНГИБИТОРАМИ ПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ВИЧ-1 И ВИЧ-2 Российский патент 2003 года по МПК C07H19/06 A61K31/7072 A61P31/18 

Изобретение относится к вирусологии и касается новых биологически активных соединений, а именно замещенных аммониевых солей 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы:

где RR'R''N - представляют собой L-аланин, этаноламин, триэтаноламин, 6-аминокапроновую кислоту, пиридоксиламин или диметиламиноэтанол.

Новые соединения обладают способностью селективно ингибировать продукцию вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), что позволяет предполагать возможность их использования в медицине для лечения людей, инфицированных ВИЧ и больных СПИД.

В настоящее время известны различные соединения, ингибирующие продукцию вируса иммунодефицита человека. Наибольшее распространение из них получил 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ) [Mitsuya Н. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7096-7070].

Известны также 5'-фосфонаты 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов, в том числе, 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина [Патент СССР 1548182, кл. С 07 Н 19/073, 1987], которые обладают ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2, но при этом менее токсичны, чем АЗТ. Однако создание лекарственной формы на основе 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов крайне затруднено из-за их высокой гигроскопичности. Известны также соли щелочных и щелочноземельных металлов 5'-фосфонатов 3'-азидо-2', 3'-дидезоксинуклеозидов [Патент РФ 2106353, кл. С 07 Н 19/073, 1996], однако не все из них по разным причинам удовлетворяют требованиям к созданию хорошей лекарственной формы.

Заявляемые замещенные аммониевые соли 5'-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина по активности и токсичности не уступают солям щелочных и щелочноземельных металлов, а также кислотной форме 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина, но в то же время им присуща лучшая способность к кристаллизации, большая чистота и меньшая гигроскопичность. Кроме того, новые соли расширяют круг соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Новые вещества представляют собой белые кристаллические порошки, хорошо растворимые в воде, ограниченно растворимые в спиртах, хлороформе, хлористом метилене.

Их получение проводят добавлением эквимолярного количества соответствующего аминосоединения к кислотной форме 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Образующиеся соли упаривают до малых объемов, из которых начинается самопроизвольная кристаллизация, и оставляют при 4^oС на 5-6 ч до окончания кристаллизации, выпавшие осадки отфильтровывают, промывают малыми объемами охлажденной до 4^oС воды и сушат. Выход целевых веществ составляет 95-98%.

Чистота и структура новых соединений подтверждены данными ВЭЖХ, УФ- и ЯМР-спектроскопии.

Ниже приводятся примеры получения замещенных аммониевых солей 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

Пример 1. Синтез соли L-аланилата 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (I)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 200 мл (0,5 моля) 2,5 н. раствора L-аланина. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 201 г (95,8%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте КН₂РO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 266 нм (ε 9600). ¹Н ЯМР (D₂О; δ, м.д.; J, Гц): 1.33 д (3Н, СН₃ (аланин), J_CH3-CH 6,5 Гц); 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 4,65-3,90 м (5Н, Н3'+Н4'+2Н5'+СН (аланин)); 6,15 т (1Н, H1', J_H1'-H2' 6 Гц), 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-CH3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.; J, Гц): 6,5 д (1Н, Н^P J_H-P 626 Гц, J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 2. Синтез этаноламмониевой соли 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (II)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моля) 5 н. раствора этаноламина. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 186 г (94,9%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте КН₂РO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 266 нм (ε 9600). ¹H ЯМР (D₂О): 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 3,19 т (2Н, CH₂N (этаноламин), J_CH2-CH2 5 Гц); 3,61 т (2Н, СН₂O (этаноламин), J_CH2-CH2 5 Гц); 4,65-3,90 м (4Н, Н3'+Н4'+2Н5'); 6,15 т (1Н, H1', J_H1'-H2' 6 Гц), 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-CH3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O): 6,5 д (1Н, Н^P, J_H-P 626 Гц, J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 3. Синтез триэтаноламмониевой соли 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (III)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моля) 5 н. раствора триэтаноламина. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 233 г (97,1%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте KH₂PO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 266 нм (ε 9600). ¹Н ЯМР (D₂О): 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 3,22 т (6Н, 3CH₂N (триэтаноламин), J_CH2-CH2 5 Гц); 4,65-3,90 м (10Н, Н3'+Н4'+2Н5'+3CH₂O (триэтаноламин)); 6,15 т (1Н, Н1', J_H1'-H2' 6 Гц), 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-Ch3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O): 6,5 д (1Н, Н^P, J_H-P 626 Гц, J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 4. Синтез 6-аминогексаноата 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (IV)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированой воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 200 мл (0,5 моля) 2,5 н. раствора 6-аминокапроновой кислоты. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 195 г (84,2%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH2 в линейном градиенте КН₂РO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 266 нм (ε 9600). ¹Н ЯМР (D₂O): 1,34-1,69 м (6Н, 3CH₂ (аминокапроновая кислота)); 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,36 т (2Н, СН₂СООН (аминокапроновая кислота), J_CH2-CH2 7 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 3,02 т (2Н, CH₂N (аминокапроновая кислота), J_CH2-CH2 7 Гц); 4,65-3,90 м (4Н, Н3'+Н4'+2Н5'); 6,15 т (1Н, H1', J_H1'-H2' 6 Гц), 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-CH3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O): 6,5 д (1Н, Н^P, J_H-p 626 Гц, J_Р-Н5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 5. Синтез пиридоксиламмониевой соли 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (V)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 250 мл (0,5 моля) 2 н. раствора пиридоксиламина. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 237 г (94,9%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте КН₂РO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 261 нм (ε 14300). ¹Н ЯМР (D₂O): 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 2,77 с (3Н, СН₃ (пиридоксиламин)); 4,65-3,90 м (6Н, Н3'+Н4'+2Н5'+CH₂NH₂ (пиридоксиламин)); 4,84 с (2Н, CH₂OH (пиридоксиламин)); 6,15 т (1Н, H1', J_H1'-H2' 6 Гц); 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-CH3 1 Гц); 8,08 с (1Н, Аr (пиридоксиламин)). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂О): 6,5 д (1Н, Н^P, J_H-p 626 Гц, J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Пример 6. Синтез (гидроксиэтил)диметиламмониевой соли 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина (VI)
К раствору 165 г (0,5 моля) кислой формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 200 мл дистиллированной воды при охлаждении водой со льдом и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моля) 5 н. раствора диметиламиноэтанола. Образовавшийся прозрачный бесцветный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре бани не более 45^oС до 130-150 мл суммарного объема и оставляют на 6 ч при 4^oС. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 40 мл охлажденной до 4^oС дистиллированной воды и сушат в вакууме. Выход 199 г (94,9%), т.пл. >300^oС (с разложением). Вещество не гигроскопично.

Время удерживания нуклеотидной компоненты на колонке Nucleosil 120-7 NH₂ в линейном градиенте КН₂РO₄ (0,05-1 М) 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

УФ-спектр (вода): λ_max 266 нм (ε 9600). ¹Н ЯМР (D₂О): 1,93 д (3Н, СН₃, J_CH3-H6 0,5 Гц); 2,55 м (2Н, Н2'); 2,84 с (3Н, СН₃ (диметиламиноэтанол)); 3,21 т (2Н, CH₂N (диметиламиноэтанол), J_CH2-CH2 5 Гц); 3.93 т (2Н, СН₂О (диметиламиноэтанол), J_CH2-CH2 5 Гц); 4,65-3,90 м (4Н, Н3'+Н4'+2Н5'); 6,15 т (1Н, H1', J_H1'-H2' 6 Гц), 7,66 д (1Н, Н6, J_H6-CH3 1 Гц). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O): 6,5 д (1Н, Н^P, J_H-p 626 Гц, J_P-H5' 6,3 Гц, J_P-H4' 1,6 Гц).

Были изучены биологические свойства новых соединений, а именно их способность селективно ингибировать продукцию ВИЧ и токсичность для клеток. Исследования проводили на культурах лимфоцитов человека - перевиваемых лимфобластоидных линиях клеток человека H9/IIIB, МТ-4 и PBL. Продукция вируса клетками определялась методами непрямой иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа по [Тарусова Н. Б., Хорлин А.А., Краевский А.А. и др. Мол. Биол. 1989, 23, 1716-1723, Краевский А.А., Тарусова Н.Б., Жу К.-Ю, и др.. Мол. Биол. 1992, 26, 624-633,. Dyatkina N., Arzumanov A., Krayevsky A. at al. , Nucleosides & Nucleotides, 1994, 13, 325-337]. Активность соединений характеризовали величиной ЭД - концентрации, подавляющей продукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на 50%, токсичность - величиной ТД, а именно концентрации, подавляющей рост неинфицированных клеток на 50%. Индекс селективности вычисляли как отношение ТД к ЭД. Для сравнения использовали кислотную форму 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Данные экспериментов приведены в табл. 1-3.

Таким образом, новые вещества - замещенные соли 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина ингибируют репродукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культурах лимфоцитов человека Н9, МТ-4 и PBL примерно с той же активностью, с которой это наблюдалось и для кислотной формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Токсичность заявляемых замещенных аммониевых солей 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина также находится в пределах токсичности кислотной формы 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. В то же время новые соединения позволяют сделать процесс получения лекарственных форм на их основе более технологичным.

Изобретение относится к замещенным аммониевым солям 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы (1), где RR'R''N представляют собой L-аланин, этаноламин, триэтаноламин, 6-аминокапроновую кислоту, пиридоксиламин или диметиламиноэтанол, являющимся селективными ингибиторами продукции вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Соединения по изобретению обладают улучшенной способностью к кристаллизации и меньшей гигроскопичностью по сравнению с солями 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина с щелочными и щелочноземельными металлами. 3 табл.

Замещенные аммониевые соли 5'-Н-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы

где RR'R''N представляют собой L-аланин, этаноламин, триэтаноламин, 6-аминокапроновую кислоту, пиридоксиламин или диметиламиноэтанол, являющиеся селективными ингибиторами продукции вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2.