СОЛИ 5'-АМИНОКАРБОНИЛФОСФОНАТА 3'-АЗИДО-3'-ДЕЗОКСИТИМИДИНА, ЯВЛЯЮЩИЕСЯ СЕЛЕКТИВНЫМИ ИНГИБИТОРАМИ ПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ВИЧ-1 Российский патент 2012 года по МПК C07H19/10 A61K31/70 A61P31/18 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины и касается новых биологически активных соединений, а именно солей 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Новые соединения обладают способностью селективно ингибировать продукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что позволяет предполагать возможность их использования в медицине для лечения СПИДа.

Модифицированные нуклеозиды широко применяются для лечения и профилактики многих вирусных заболеваний. Примером такого соединения является первый российский оригинальный анти-ВИЧ препарат - 5'-Н-фосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина (Никавир^®). Будучи латентной формой 3'-азидо-3'-дезокситимидина, Никавир^® обладает рядом преимуществ над ним: он менее токсичен для пациентов и обладает более узким спектром побочных действий, его время выведения из организма вдвое больше, что позволяет снизить частоту приема, и, наконец, резистентность к нему вырабатывается гораздо медленнее и на значительно более низком уровне.

5'-Аминокарбонилфосфонат 3'-азидо-3'-дезокситимидина, как и Никавир^®, является депо-формой 3'-азидо-3'-дезокситимидина [RU 2322450 C2. Модифицированные 5'-фосфонаты АЗТ в качестве активных компонентов для потенциальных противовирусных препаратов; Ясько М.В., Шипицын А.В., Хандажинская А.Л. и др. // Новые производные алкил- и аминокарбонилфосфоновых кислот, содержащие 3'-азидо-3'-дезокситимидин. // Биоорганическая химия, 2006, 32(6), 603-608; Khandazhinskaya A.L, Yanvarev D.V., Jasko M.V. et al. // 5'-Amino-carbonyl phosphonates as new zidovudine depot forms: antiviral properties, intracellular transformations, and pharmacokinetic parameters. // Drug Metabolism and Disposition, 2009, 37(3), 494-501], однако создание лекарственной формы на его основе крайне затруднено из-за его нестабильности.

Заявляемые соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина описываются общей формулой:

где R - ион щелочного или щелочно-земельного металла или ион аммония с различными заместителями, которые одинаковы или различны и представляют собой: водород; природные α-аминокислоты и их эфиры; первичные, вторичные и третичные аминокислоты и их эфиры алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов; первичные, вторичные и третичные аминоспирты алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов; первичные, вторичные и третичные амины и полиамины алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов.

Заявляемые соли по активности и токсичности не уступают кислотной форме 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина, но в то же время превосходят ее по способности к кристаллизации и стабильности. Кроме того, новые соли расширяют круг соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении ВИЧ-1.

Новые вещества представляют собой белые кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде, ограниченно растворимые в спиртах, практически не растворимые в хлороформе.

Их получение проводят добавлением к кислотной форме 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина эквимолярного количества аммиака, соответствующего амино-соединения или гидроксида щелочного или щелочно-земельного металла. Образующиеся растворы солей упаривают до малых объемов, из которых начинается самопроизвольная кристаллизация, и оставляют при 4°C до окончания кристаллизации, выпавшие осадки отфильтровывают и сушат в вакууме. Выход целевых соединений составляет 95-98%.

Чистота и структура новых соединений подтверждены данными ВЭЖХ, УФ- и ЯМР-спектроскопии.

Был проведен анализ стабильности полученных соединений в виде 1% водных растворов при комнатной температуре. Кислая форма 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина деградирует за месяц на 40%, аммонийная соль - на 2%, для остальных солей в течение месяца продуктов деструкции детектировано не было.

Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре перевиваемых лимфоцитов МТ-4, обеспечивая защиту клеток от цитопатогенного действия вируса, и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток, вплоть до крайне высоких концентраций (таблица). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50% токсические дозы на 2-4 порядка превышают 50% ингибирующие дозы), в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1-го типа в культуре клеток МТ-4. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для кислотной формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Вирусологические тесты проведены в соответствии с описанными ранее протоколами.

Ниже приведены примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1.

Синтез натриевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 Н раствора гидроксида натрия. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 191,2 г (96,5%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,5 нм (ε 9800).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,56 (1Н, с, Н6), 6,12 (1H, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,38 (1Н, м, H3'), 4,17 (3H, м, Н4', Н5'), 2,38 (2Н, т, J 6,2 Гц, Н2'), 1,79 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,42 (c).

Пример 2.

Синтез калиевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 H раствора гидроксида калия. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 200,6 г (97,3%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 267,0 нм (ε 9600).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,67 (1Н, c, Н6), 6,21 (1Н, т, J 6,6 Гц, H1'), 4,50 (1Н, м, H3'), 4,19 (3H, м, Н4', Н5'), 2,49 (2Н, т, J 6,6 Гц, Н2'), 1,91 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: - 1,59 (c).

Пример 3.

Синтез кальциевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 1000 мл (0,25 моль) 0,5 Н предварительно отфильтрованного раствора гидроксида кальция. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 200 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 192,9 г (98,1%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,8 нм (ε 9400).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,59 (1Н, с, Н6), 6,15 (1H, т, J 6,6 Гц, H1'), 4,41 (1H, м, H3'), 4,10 (3H, м, Н4', Н5'), 2,41 (2Н, т, J 5,9 Гц, Н2'), 1,82 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,59 (c).

Пример 4.

Синтез бариевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 1000 мл (0,25 моль) 0,5 Н предварительно отфильтрованного раствора гидроксида бария. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 300 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 216,3 г (97,9%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,7 нм (ε 9400).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,65 (1Н, с, Н6), 6,20 (1H, т, J 6,6 Гц, H1'), 4,47 (1Н, м, H3'), 4,16 (3H, м, Н4', Н5'), 2,46 (2Н, т, J 6,5 Гц, Н2'), 1,87 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,56 (c).

Пример 5.

Синтез аммониевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 H раствора аммиака. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 186,2 г (95,2%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,8 нм (ε 9650).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,65 (1H, с, Н6), 6,20 (1H, т, J 6,5 Гц, H1'), 4,46 (1H, м, H3'), 4,16 (3H, м, Н4', Н5'), 2,46 (2Н, т, J 5,9 Гц, Н2'), 1,87 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,59 (c).

Пример 6.

Синтез соли L-аланина и 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 200 мл (0,5 моль) 2,5 Н раствора L-аланина. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 221,5 г (95,8%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,8 нм (ε 9600).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,63 (1H, с, Н6), 6,21 (1Н, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,43 (1H, м, H3'), 4,25 (1Н, кв, J 6,5 Гц, СН (аланин)), 4,10 (3H, м, Н4', Н5'), 2,45 (2Н, т, J 6,0 Гц, Н2'), 1,84 (3H, с, 5-СН₃), 1,33 (3H, д, J 6,5 Гц, СН₃ (аланин)).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,57 (c).

Пример 7.

Синтез этаноламмониевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 Н раствора этаноламина. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 208,3 г (95,9%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,8 нм (ε 9900).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,61 (1H, с, Н6), 6,17 (1Н, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,48 (1H, м, H3'), 4,18 (3H, м, Н4', Н5'), 3,61 (2Н, т, J 5,0 Гц, CH₂O (этаноламин)), 3,19 (2Н, т, J 5,0 Гц, CH₂N (этаноламин)), 2,45 (2Н, т, J 6,1 Гц, Н2'), 1,86 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,55 (c).

Пример 8.

Синтез триэтаноламмониевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 Н раствора триэтаноламина. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 255,5 г (97,8%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,9 нм (ε 9700).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,58 (1Н, с, Н6), 6,15 (1Н, т, J 6,5 Гц, H1'), 4,39 (1H, м, H3'), 4,09 (3H, м, Н4', Н5'), 3,88 (6Н, т, J 5,0 Гц, 3CH₂O (триэтаноламин)), 3,22 (6Н, т, J 5,0 Гц, 3CH₂N (триэтаноламин)), 2,41 (2Н, т, J 6,0 Гц, Н2'), 1,80 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,53 (c).

Пример 9.

Синтез соли 6-аминокапроновой кислоты и 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 200 мл (0,5 моль) 2,5 H раствора 6-аминокапроновой кислоты. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 232,7 г (94,9%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,6 нм (ε 9900).

¹H-ЯМР (D20), м.д.: 7,64 (1Н, с, Н6), 6,20 (1Н, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,46 (1H, м, H3'), 4,46 (3H, м, Н4', Н5'), 3,02 (2Н, т, J 7,1 Гц, CH₂N (аминокапроновая кислота)), 2,45 (2Н, т, J 6,1 Гц, Н2'), 2,34 (2Н, т, J 7,1 Гц, CH ₂COOH (аминокапроновая кислота)), 1,87 (3H, с, 5-СН₃), 1,52 (6Н, м, 3CH₂ (аминокапроновая кислота)).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,57 (c).

Пример 10.

Синтез пиридоксиламмониевой соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 250 мл (0,5 моль) 2 Н раствора пиридоксиламина. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 261,2 г (96,5%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 261 нм (ε 14100).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 8,08 (1Н, с, Ar (пиридоксиламин)), 7,65 (1Н, c, Н6), 6,20 (1Н, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,84 (2Н, с, CH ₂OH (пиридоксиламин)), 4,48 (1H, м, H3'), 4,21 (2Н, с, CH ₂NH₂ (пиридоксиламин)), 4,09 (3H, м, Н4', Н5'), 2,77 (3H, с, СН₃ (пиридоксиламин)), 2,47 (2Н, т, J 6,1 Гц, Н2'), 1,89 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,51 (c).

Пример 11.

Синтез соли диметиламиноэтанола и 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

К раствору 187 г (0,5 моль) кислой формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина в 350 мл дистиллированной воды при температуре 4°C и перемешивании в течение 20 мин приливают 100 мл (0,5 моль) 5 Н раствора диметиламиноэтанола. Образовавшийся раствор упаривают на роторном испарителе (температура бани 40°C) до объема 100-150 мл и оставляют при температуре 4°C до окончания кристаллизации. Выпавший мелкокристаллический осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают 20 мл охлажденной до 4°C воды и сушат в вакууме. Выход: 221,2 г (95,7%).

Время удерживания на колонке Luna 100 C₁₈₍₂₎ 150×4,6 мм - 2,4 мин (подвижная фаза: 0,05 М раствор ацетата аммония - ацетонитрил в объемном соотношении 8:1, температура колонки 40°C, скорость потока 1 мл/мин).

УФ-спектр (вода): λ_max 266,7 нм (ε 9800).

¹H-ЯМР (D₂O), м.д.: 7,67 (1Н, с, Н6), 6,24 (1Н, т, J 6,7 Гц, H1'), 4,49 (1H, м, H3'), 4,18 (3H, м, Н4', Н5'), 3,93 (2Н, т, J 5,0 Гц, CH₂O (диметиламиноэтанол)), 3,21 (2Н, т, J 5,0 Гц, CH₂N (диметиламиноэтанол)), 2,51 (6Н, с, СН₃ (диметиламиноэтанол)), 2,41 (2Н, м, Н2'), 1,89 (3H, с, 5-СН₃).

³¹Р-ЯМР (D₂O), м.д.: -1,50 (c).

Пример 12.

Исследования ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ).

Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведения в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии МТ-4, помещенной в лунки 96-луночного планшета (Cel-Cult, England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°C в течение 4 суток. Посевная концентрация составляет 0,5×10⁶ клеточных частиц в миллиметре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4-е сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток МТТ). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным данным строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки МТ-4 в эффективных концентрациях. Следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 2-4 порядка превышают эффективные в отношении ВИЧ-1 дозы (таблица 1).

Влияние исследуемых соединений на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 исследовано по известной методике.

Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS), считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе (результаты представлены в таблице). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4, сравнимой с эффективностью кислотной формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина.

  Противовирусная активность солей 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина против ВИЧ-1 ГВК4046 Соединение CD₅₀, µM ID₅₀, µM IS R=Na 2,7 1,2 2250 R=K 2,5 0,9 2778 R=Ca 1,9 1 1900 R=Ва 3,5 1,3 2692 R=NH₄ 2,7 0,8 3375 R=NH₂CH(CH₃)COOH 2,9 0,9 3222 R=NH₂CH₂CH₂OH 2,8 1,1 2545 R=N(CH₂CH₂OH)₃ 3 0,9 3333 R=NH₂(CH₂)₅COOH 3,2 0,8 4000 R=пиридоксиламин 2,1 1 2100 R=N(CH₃)₂CH₂CH₂OH 2,7 0,9 3000 Кислая форма (контроль) 2,6 0,8 3250

Таким образом, новые вещества - соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина - ингибируют размножение ВИЧ-1 в культурах клеток лимфоцитов, причем примерно с той же активностью, с которой это наблюдалось и для кислотной формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. Токсичность заявляемых солей 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина также находится в пределах токсичности кислотной формы 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина. В то же время новые соединения являются более стабильными, что облегчает создание лекарственных форм на их основе.

Настоящее изобретение относится к солям 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина с активностью против вируса ВИЧ-1 общей формулы

.

где R - ион щелочного или щелочно-земельного металла или ион аммония с различными заместителями. Технический результат - получение новых соединений, которые обладают способностью селективно ингибировать продукцию вируса иммунодефицита человека и являются стабильными веществами, что облегчает создание лекарственных форм на их основе. 1 табл.

Соли 5'-аминокарбонилфосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина общей формулы:
,
где R - ион щелочного или щелочно-земельного металла или ион аммония с различными заместителями, которые одинаковы или различны и представляют собой: водород; природные α-аминокислоты и их эфиры; первичные, вторичные и третичные аминокислоты и их эфиры алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов; первичные, вторичные и третичные аминоспирты алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов; первичные, вторичные и третичные амины и полиамины алифатического, ароматического, карбоциклического и гетероциклического рядов, являющиеся селективными ингибиторами продукции вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1.