СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КАНДИДОЗА ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 A61K35/84 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической микологии.

Известен способ диагностики кандидоза путем определения титров антител в сыворотке крови к Candida albicans в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и в иммуноферментном анализе (ИФА) у ВИЧ-инфицированных больных [1,2,3]. Недостатками способов является низкая надежность этих тестов в серологической диагностике кандидоза низкой специфичности РНГА (40%) и низкой чувствительности ИФА (33%). Кроме того, описано применение этих тестов для диагностики кандиноза, но не его клинических форм.

Цель изобретения является создание диагностики клинической формы кандидоза.

Указанная цель достигается тем, что исследуют титры антител к Candida albicans в сыворотке крови одновременно в двух реакциях - РНГ и ИФА - и при выявлении титров антител вышедиагностических только в РНГА (величина титра > - log₂ 6) диагностируют поверхностный кандидоз, а при выявлении титров антител выше диагностических в РНГА и ИФА ( величина титра > 1:400) диагностируют глубокий кандидоз.

Способ осуществляют следующим образом.

Постановку реакции непрямой гемагглютинации осуществляли с применением микротитратора Такачи в объеме 0,1 мл. В качестве диагностикума использовали форманилизированные эритроциты барана (ФЭБ), сенсабилизированные тотальным гликопротеидным антигеном клеточной стенки Candida albicans (4). Разбавителем в реакции служил фосфатный забуференный физиологический раствор (ЗФР) с pH 7,2. Постановку реакции осуществляли следующим образом. В лунках планшеты готовили двукратные разведения исследуемой сыворотки крови в ЗФР от 1:2 до 1: 32768 (т.е. от log₂1 до - log₂ 15), затем добавляли в каждую лунку равное количество эритроцитарного диагностикума. Параллельно с опытом, используя те же объемы жидкостей, ставили 3 контрольные пробы для оценки специфичности реакции:
1) разбавитель + диагностикум,
2) разбавитель + ФЭБ
3) минимальное разделение исследуемой сыворотки + ФЭБ.

Планшеты накрывали и инкубировали при 37^o в течение двух часов, после чего учитывали результаты реакции. При отрицательных результатах эритроциты осаждались на дно лунки в виде кружевной пленки с фестончатыми краями. Результаты реакции оценивали в двоичных логарифмах.

Определение антител к Candida albicans проводили в непрямом варианте ИФА с использование стандартных ИФА-тестсистем. Для постановки анализа в лунки полистирового планшета с иммобилизированным антителом Candida albicans вносили по 0,1 мл двукратных разведений, начиная с диагностического, исследуемых сывороток в 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе 0,05% твина-20 (ФСБ-Т) и инкубировали в течение 1 ч при 37^oC. После трехкратной промывки ФСБ-Т всех трех лунок планшета, в каждую из них вносили по 0,1 мл коньюгата (белок А - пероксидаза хрена) в концентрации 200 нг/мл. Планшет инкубировали 1 ч при 37^oC, а затем все лунки планшета промывали 5 раз ФСБ-Т. После промывки во все лунки добавляли по 0,1 мл раствора субстрата (0,05% о-финилендиамин дигидрохлорид с 0,06% перекиси водорода в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере, pH 5,0). Для развития ферментативной реакции планшет помещали в темное место на 20 мин, после чего в каждую лунку добавляли по 0,1 мл 1 М раствора серной кислоты. В качестве положительного и отрицательного контроля при постановке ИФА использовали γ -глобулин здорового человека в концентрации 1: 1000 и гипериммунную кроличью сыворотку к Candida albicans в концентрации 1: 1600. Диагностическое разведение сывороток больных - 1:400. Учет результатов ИФА проводили с помощью фотометра КАИ-Ц-01 при длине волны 490 нм. Реакцию оценивали в том случае, если оптическая плотность отрицательного контроля не превышала значения 0,2, а показатель положительного контроля превосходил значение 0,5. При определении титра специфических антител регистрировали последнее разведение исследуемой сыворотки, которое обеспечивало значение оптической плотности не ниже 0,2.

Проведено исследование 78 ВИЧ-инфицированных больных. По результатам комплексного обследования у 36 из них был диагностирован поверхностный кандидоз, у 18 - глубокий, а у 24 кандидоз отсутствовал. У 32 из 36 больных поверхностным кандидозом зарегистрированы повышенные титры антител к Cadida albicans только в РНГА. При глубоком кандидозе - у 10 из 18 были определены положительные реакции и в РНГА, и а ИФА (Таблица).

Пример 1. Больной г., 24 лет, гомосексуалист. Был выявлен за два года до поступления при обследовании по контакту с ВИЧ-инфицированным половым партнером. Предъявлял жалобы на быструю утомляемость, потливость, потерю массы тела более чем на 10%. При осмотре выявлен ряд патологических изменений: увеличение периферических лимфатических узлов, гепатомегалия, белый налет на языке, гиперимия миндалин. В посевах слизи из зева и в соскобах с языка - рост Candida albicans. В мазках из зева был также рост Staphyloccus aureus. Титр антител к Candida albicans в сыворотке крови в РНГА был равен - log₂5, в ИФА - 1:200. Оба показателя были в пределах нормы, что указывало на отсутствие кандидоза.

На фоне антибактериальной терапии воспаление миндалин регрессировало, что указывало на отсутствие кандидоза и подтверждало бактериальный тонзилит.

Пример 2. Больной П., 38 лет. Заражен ВИЧ в гетеросексуальных контактах предположительно два года назад. За два года наблюдения у больного впервые появились образования на обеих поверхностях языка. Жаловался на жжение и болезненность в зоне поражения. Образования имели неправильную форму, неровные очертания, беловато-перламутровую окраску, плотную консистенцию, были спаяны со слизистой. Макроскопическая картина напоминала волосистую лейкоплакию. Титр антител к Candida albicans в сыворотке крови в РНГА - log₂9, в ИФА - 1: 100, т.е. был выявлен титр выше диагностического в РНГА, что соответствовало поверхностному кандидозу. При исследовании материала из зоны поражения был выявлен мицелий гриба, получен рост Candida albicans и обнаружены цитологические признаки глоссита. В последующем эффект антимикотической терапии кандидозную природу глоссита, протекавшего в виде волосатой лейкоплакии (гиперпластический вариант кандидоза).

Пример 3. Больной К., 35 лет, был заражен в гомосексуальных контактах. Сроки инфицирования неизвестны. Поступил по поводу сильной головной боли, слабости, лихорадки до 39^oС. Состояние средней тяжести. Сознание ясное. Признаков поражения ЦНС не выявлено, в том числе и менингеальных знаков. Слизистая оболочка полости рта гиперемированная, рыхлая; на слизистой щеки - белый налет и единичные энантемы. В посевах слизи ротовой полости - рост Candida albicans, Candida tropicalis и Staphylococcus aureus. При этом титры антител к Candida albicas в сыворотке крови в РНГА был равен - log₂7 и в ИФА - 1: 1600, что указывало на системный микоз. С диагностической целью была выполнена спинномозговая пункция. В ликворе обнаружен рост Candida albicans. Таким образом, у больного кроме кандидо-бактериального стоматита имел место менингит, вызванный Candida albricans.

Предлагаемый способ обеспечивает хорошее качество диагностики клинической формы кандидоза. Для диагностики поверхностного кандидоза чувствительность метода равна 94,12%, специфичность - 47,62%, эффективность - 76,36%. Диагностика глубокого кандидоза осуществляется с чувствительностью 83,33%, специфичностью - 76,92%, эффективностью - 80%.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики кандидоза имеет высокую надежность в решении сложной диагностической задачи разграничения поверхностного и глубокого кандидоза у ВИЧ-инфцированных больных.

Литература.

1. Гяургиева О.Х., Бабенко Г.А., Игнатьева С.М., Лебедева Т.Н. - Эффективность серологической диагностики кандидоза у ВИЧ-инфицированных больных. - "Актуальные проблемы научной и практической дерматологии и венерологии" (Республиканский межведомственный сборник), вып.5, Днепропетровск, 1994, с. 400.

2. Гяургиева О.Х., Лебедева Т.Н., Ильина В.Я. - Титры антител к Candida albicans у ВИЧ-инфицированных больных.- Материалы международного симпозиума "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", СПб, 1995, с.108.

3. Гяургиева О. Х. , Лебедева Т.Н., Ильина В.Я. - Сравнительная оценка серологических тестов в диагностике кандидоза при ВИЧ-инфекции. Материалы международной микологической конференции "Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии", СПб, 1995,
4. Лебедева Т. Н. - Антигенный диагностикум для определения антител у больных кандидозом. - Лабораторное дело, 1980, N 12, с. 620-621.

Способ диагностики кандидоза при ВИЧ-инфекции основан на учете результатов двух серологических тестов -РНГА и ИФА - одновременно. При выявлении титров антител к Candida albicans в сыворотке крови выше диагностических только в РНГА диагностируют поверхностный кандидоз, а при выявлении титров антител к Candida albicans в сыворотке крови выше диагностических одновременно в двух реакциях - в РНГА и ИФА (> 1 : 400) диагностируют глубокий кандидоз. Эффективность предлагаемого способа диагностики 76,36 и 80% для каждой клинической формы соответственно. 1 табл.

1. Способ диагностики кандидоза при ВИЧ-инфекции путем исследования титра антител к Candida albicans в сыворотке крови, отличающийся тем, что исследование титров антител проводят одновременно в двух реакциях - реакции непрямой геммаглютинации (РНГА) и в иммуноферментном анализе (ИФА) - и в случае положительной РНГА диагностируют поверхностный кандидоз, а при положительном результате в двух реакциях диагностируют глубокий кандидоз.