СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ КЛОСТРИДИОЗАХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/531 A61K39/08 

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики анаэробной энтеротоксемии (клостридиоза) сельскохозяйственных животных и может быть использован в ветеринарной медицине.

Анаэробная энтеротоксемия - остропротекающая болезнь животных различных видов (овец, телят, поросят, пушных зверей, птиц и др.) первых дней жизни, характеризующаяся общим токсикозом организма с признаками поражения нервной системы и желудочно-кишечного тракта, возникающая в результате интенсивного размножения в кишечнике различных типов Cl. perfringens и всасывания образовавшихся при этом токсинов [1, 15-17].

Возбудитель болезни - Cl. perfringens, который по выделению токсинов подразделяют на шесть типов: А, В, С, D, Е и F, которые отличаются друг от друга антигенной структурой вырабатываемых ими токсинов. У ягнят анаэробную энтеротоксемию вызывает возбудитель типов В, D; у телят -типы А, С, D; у поросят - в основном тип С, реже другие [2-4, 12-14].

На сегодняшний день диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований [5, 11].

Диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных считают установленным в случае:

- обнаружения токсина в фильтрате содержимого тонкого отдела кишечника биологическим методом и определения его типа в реакции нейтрализации с типоспецифическими сыворотками;

- выделения из содержимого тонкого отдела кишечника культуры, продуцирующей токсин, тип которого установлен в реакции нейтрализации с типоспецифическими сыворотками, с характерными для данного возбудителя свойствами.

Недостатками лабораторного метода являются:

- трудоемкость и длительность исследований, требующая для постановки диагноза до 8 рабочих дней [10];

- высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).

Так же в настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных. Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, используемых для серологической диагностики различных инфекционных заболеваний, таких как сальмонеллез, микоплазмоз, эшерихиоз [6-8]. В доступных источниках научно-технической литературы не обнаружена информация о способе приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к Cl. perfringens.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения иммуноферментной тест-системы для определения специфических антител к четырем серотипам Cl. perfringens (А, В, С, D) [9]. Однако недостатками метода ИФА являются трудоемкость, длительность процедуры проведения реакции, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в разработке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для определения специфических антител к бактериям Cl. perfringens, обладающей высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющей одновременно определять специфические антитела к пяти серотипам Cl. perfringens (А, В, С, D, Е) и по их титрам достоверно диагностировать анаэробную энтеротоксемию среди невакцинированного поголовья и контролировать напряженность поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных.

Для достижения названного технического результата разработан набор препаратов для постановки РНГА, содержащий специфический эритроцитарный антиген, изготовленный путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана смесью анатоксинов пяти штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е), полученных из культуральной среды путем осаждения сульфатом аммония инактивированных формалином токсинов при температуре 37°С (анатоксинов) и соматическими антигенами, полученными путем воздействия на штаммы Cl. perfringens №28, LD-1, №392, №213, №342 ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 мин при температуре 4°С, а также контрольную положительную сыворотку, полученную к антигенам Cl. perfringens №28, LD-1, №392, №213, №342 с активностью в РНГА 1:256 и контрольную отрицательную сыворотку.

Предлагаемая реакция непрямой гемагглютинации высоко чувствительна и специфична, экспрессивна, не требует дорогостоящего оборудования, проста в постановке. Реакцию можно поставить даже в условиях животноводческих комплексов, что немаловажно, когда необходимо быстро поставить диагноз.

Способ получения эритроцитарного диагностикума для РНГА включает в себя:

- получение антигенов и анатоксинов Cl. perfringens;

- сенсибилизация эритроцитов смесью антигенов и анатоксинов;

- получение контрольных положительной и отрицательной сывороток.

Заявляемый способ иллюстрируется примерами получения эритроцитарного антигенного диагностикума.

Пример 1. Получение антигенов, необходимых для сенсибилизации эритроцитов, из производственных штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е). Получают два вида антигена - анатоксин и соматический антиген.

1.1. Получение анатоксинов.

Анатоксины Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е получают путем посева штаммов на мясо-печеночно-казеиновую среду под вазелиновым маслом. Посевы инкубируют в течение 8-12 ч при температуре 37-38°С. При этом концентрация токсинов в культуры достигает до 4-5 Dlm/см³. Для превращения токсинов в анатоксин в культуру добавляют формалин до 0,5%-ной конечной концентрации и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 10 суток. Затем после удаления вазелинового масла культуру центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 30 минут. Осадок, представлявший собой бактериальные клетки Cl. perfringens, удаляют, а анатоксин (надосадочную жидкость) используют для сенсибилизации эритроцитов. Очистку и концентрирование анатоксина проводят методом осаждения его сульфатом аммония путем добавления его до 50% к общему объему (в конечной концентрации). Далее смесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 минут, затем осадок ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:10. Полученный анатоксин диализируют против дистиллированной воды в течение 24 ч.

1.2. Получение соматического антигена.

Штаммы Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е высевают на мясопептонный агар с добавлением 2% глюкозы и 15% крови барана. Получают суточную культуру посредством культивирования в анаэростате при температуре 37°С. Выросшую культуру смывают 0,85% изотоническим раствором хлористого натрия. Бактериальную взвесь трижды отмывают стерильным физиологическим раствором для освобождения от компонентов питательной среды путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 минут. Осадок микробных клеток разводят стерильным физиологическим раствором до получения взвеси 20 млрд. микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности им. Л.А. Тарасевича. Микробные клетки разрушают ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 минут при температуре 4°С. Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осадок удаляют, надосадочную жидкость используют в качестве антигена для сенсибилизации эритроцитов барана.

В антигенах, приготовленных 1 и 2 способами, измеряют концентрацию белка с помощью спектрофотометра по методу Лоури. Концентрацию белка доводят до 0,4-0,5 мг/мл фосфатно-солевым буферным раствором (рН 6,4).

Пример 2. Подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса.

2.1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума используют эритроциты барана. Кровь у баранов-доноров отбирают из яремной вены, дефибринируют по общепринятой методике и разводят ее 1:1 фосфатно-солевым буферным раствором (рН 6,4).

К 100 мл разведенной крови добавляют 20% раствор формалина порциями в возрастающих объемах через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. Смесь инкубируют в водяной бане, тщательно перемешивая после каждого внесения. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и готовят 3% взвесь эритроцитов. Эритроцитарную суспензию отстаивают при температуре (4±2)°С в течение 2 суток.

2.2. Для последующей модификации поверхности эритроцитов к полученной суспензии добавляют равный объем раствора танина (1:20000) в физиологическом растворе. Смесь инкубируют при температуре (37±1)°С на магнитной мешалке в течение 20 минут, эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и ресуспендируют в этом же растворе до 3% концентрации эритроцитов.

2.3. Для сенсибилизации эритроцитов используют смесь анатоксинов и соматических антигенов пяти серотипов Cl. perfringens (А, В, С, D, Е), соединенных в равных объемах. К 3% взвеси танизированных эритроцитов добавляют равный объем композиционной смеси антигена. Суспензию инкубируют в водяной бане при температуре (37±1)°С при непрерывном помешивании в течение 2-х часов. Затем сенсибилизированные эритроциты центрифугированием при 1500 об/мин отмывают трижды фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и ресуспендируют в этом же растворе до 3% концентрации. Полученный эритроцитарный диагностикум консервируют формалином до 1% конечной концентрации.

Пример 3. Получение контрольных сывороток.

3.1. Для получения положительной контрольной сыворотки к антигенам Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е используют десять кроликов живой массой 3,0-3,5 кг. Для гипериммунизации композиционную смесь антигенов вводят в краевую вену уха трижды с интервалом 4 дня. На первом этапе объем вводимой смеси составляет 0,5 мл, затем 1 мл и 2 мл. Через семь дней после иммунизации берут кровь для проверки титров и специфичности присутствующих антител.

3.2. Отрицательную контрольную сыворотку получают от кроликов в возрасте от полугода до года, после выдерживания их в карантине в течение 30 дней. Предварительно сыворотку крови исследуют в ИФА на содержание специфических антител.

Пример 4. Определение активности и специфичности эритроцитарного антигенного диагностикума.

4.1. Для определения активности и специфичности проводят постановку РНГА с контрольными сыворотками (положительной и отрицательной к Cl. perfringens) и гетерологическими (гипериммунные сыворотки к Escherichia coli, Moraxella bovis). Реакцию ставят в круглодонных планшетах для иммунологических реакций с объемом 200 мкл.

Контрольные сыворотки разводят с 1:8 до 1:1024. В качестве разбавителя используют 0,15 М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4. Проведены испытание трех серий эритроцитарного клостридиозного диагностикума в РНГА, результаты которых приведены в таблице 1.

Из таблицы видно, что с положительной клостридиозной сывороткой диагностикум реагирует на четыре креста до разведения 1:128, на три креста 1:256, на один крест 1:512. С гетерологичными сыворотками сомнительная реакция на два креста наблюдается в разведении 1:8. С отрицательной сывороткой и фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) наблюдается отрицательная реакция во всех разведениях.

Пример 5. Иллюстрация применения РНГА.

Ампулу с эритроцитарным антигеном тщательно встряхивают до получения однородной взвеси, вскрывают и разводят антиген в соотношении 1:2 разбавителем. В качестве разбавителя используют 0,15 М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4.

Приготовление 0,15 М фосфатно-буферного физиологического раствора. В мерную колбу на 1 л вносят 20,4 г химически чистого безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до метки 1 л (раствор А). В другую мерную колбу на 1 л вносят 26,7 химически чистого двузамещенного фосфорнокислого натрия двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят водой до метки 1 л (раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 4-6°С в течение месяца.

Для приготовления буфера к 24 мл раствора А добавляют 76 мл раствора Б и вносят 0,85 г. химически чистого хлористого натрия. С помощью рН-метра проверяют рН буфера и при необходимости доводят рН до 7,2-7,4 растворами А или Б.

Постановка реакции.

РНГА ставят с использованием микропанелей с U-образными лунками наборов для микротитрования Такачи или Титертек. В лунки микропанели с помощью многоканальной пипетки вносят по 0,05 мл разбавителя. В первые лунки одноканальной пипеткой вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 мл и последовательными переносами получают двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1:256. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена. Панель осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 6 ч. Одновременно с постановкой РНГА ставят контроли: контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитарного антигена в разбавителе. В 4-6 лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, затем по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена; контроль на отсутствие агглютинации эритроцитарного антигена отрицательной сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл отрицательной сыворотки и титруют как исследуемые сыворотки, затем в каждую лунку вносят по 0,025 мл 1-%-ной взвеси эритроцитарного антигена; контроль на активность эритроцитарного антигена со специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл специфической сыворотки и титруют как исследуемые сыворотки, 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена.

Учет реакции.

Реакцию учитывают через 2-2,5 ч. За титр в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки, дающее четкую агглютинацию (зонт).

Учет реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.

Контроль реакции.

В контрольных лунках на спонтанную агглютинацию эритроциты должны сесть в виде пуговицы или плотного кольца.

Титр отрицательной сыворотки не должен превышать 1:4.

Титр специфической сыворотки должен быть не ниже 1:128.

Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивают по титрам: положительные - 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые.

Пример 6. Испытание РНГА в производственных условиях.

При производственном испытании эффективности набора были использованы образцы крови крупного рогатого скота, доставленных из различных в эпизоотическом отношении по клостридиозам скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. При этом исследовались сыворотки крови от больных, не вакцинированных и здоровых, вакцинированных животных из неблагополучных по клостридиозам хозяйств, а также от интактных животных из благополучных хозяйств. Результаты исследования сывороток крови представлены в таблице 2.

Из таблицы видно, что РНГА обладает высокой специфичностью. Она позволяет определить специфические антитела к бактериям Cl. perfringens у 96,9% здоровых вакцинированных животных и 92,7% больных анаэробной энтеротоксемией животных.

В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по анаэробной энтеротоксемии хозяйств.

Таким образом, РНГА позволяет по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья, а также определить напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

Источники информации

1. Куриленко А.Н. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А.Н. Куриленко, В.Л. Крупальник, Н.В. Пименов. – М.: КолосС, 2006. - 296 с.

2. Салимов В.А. Некоторые особенности патологоанатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии телят, вызванной Cl. perfringens типа А / В.А. Салимов, Н.П. Салимова // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: мат. науч. - практ. конф. - Воронеж, 2002. - С. 527-528.

3. Спиридонов Г.Н. Инфекционная энтеротоксемия молодняка сельскохозяйственных животных в регионе Среднего Поволжья и Предуралья. / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, М.Т. Хурамшина, А.Г. Спиридонов // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: мат. науч. - практ. конф. - Краснообск, 2010. - С. 134-139.

4. Ургуев К.Р. Клостридиозы животных / К.Р. Ургуев // - М.: Россельхозиздат, 1987. - 183 с.

5. Хаиров С.Г. Изыскание способа индикации Clostridium perfringens / С.Г. Хаиров, Д.М. Рамазанова, Ю.С. Салихов, П.М. Кабахов, Ф.И. Исаев // Вестник ветеринарии - №48 (1/2009) - С. 48-50.

6. Патент РФ №2257581 от 25.08.2003 на изобретение «Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагнации (РНГА) при сальмонеллезах животных», Опубл.: 27.07.2005, Бюл. №21.

7. Патент РФ №2342155 от 25.04.2007 на изобретение «Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота», Опубл.: 27.12.2008, Бюл. №36.

8. Патент РФ №2449290 от 03.08.2009 на изобретение «Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума», Опубл.: 27.04.2012, Бюл. №12.

9. Патент РФ №2625031 от 11.08.2016 «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии животных и контроля напряженности поствакцинального иммунитета», Опубл.: 11.07.2017 Бюл. №20.

10. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Справочник. Под редакцией Б.И. Антонова, М.: Агропромиздат, 1986. -352 с.

11. Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной энтеротоксемии животных и анаэробной дизентерии ягнят. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Справочник. / Под ред. Б.И. Антонова, 1986.

12. Ceci L. Haemorrhagic bowel syndrome in dairy cattle: possible role of Clostridium perfringens type A in the disease complex / L. Ceci, P. Paradies, M. Sasanelly, D. de Caprariis, F. Guarda//J. Vet. Med. - 2006. - 53 - P. 518-523.

13. Gurjar A. Characterization of Toxin Plasmids in Clostridium perfringens type С isolates / A. Gurjar, J. Li, B.A. McClane // Infection and Immunity. - 2010. -78. - 11 - P. 4860-4869.

14. Kazuaki M. Enterotoxigenic Clostridium perfringens: Detection and Identification / M. Kazuaki, L. Jihong, B.A. McClane // Microbes Environ. - Vol. 27, №4, 2012. - P. 343-349.

15. Mauricio A. Navarro. Mechanisms of Action and Cell Death Associated with Clostridium perfringens Toxins / Mauricio A. Navarro, Bruce A. McClane, Francisco A. Uzal // Toxins (Basel) - 2018 May 22; 10(5).

16. Shrestha A. Enterotoxic Clostridia: Clostridiun perfringens Enteric Diseases / A. Shrestha, F.A. Uzal, B.A. McClane // Microbiology Spectrum - 2018 Sep; 6(5).

17. Van Kruiningen H.J. Clostridial abomasal disease in Connecticut dairy calves / H.J. Van Kruiningen, C.A. Nyaoke, I.F. Sidor, J.J. Fabis, L.S. Hinckley, K.A. Lindell // CVJ. - 2009. - 50 - P. 857-860.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной микробиологии и иммунологии. Предложен способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при клостридиозах животных, включающий сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана смесью анатоксинов пяти штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е) в равных соотношениях, полученных из культуральной среды путем осаждения инактивированных формалином токсинов при температуре 37°С (анатоксинов) сульфатом аммония, и соматическими антигенами, полученными путем воздействия на эти штаммы Cl. perfringens ультразвуком на дезинтеграторе при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 мин при температуре 4°С. Изобретение обеспечивает повышение специфичности и чувствительности методов лабораторной диагностики анаэробной энтеротоксемии (клостридиоза) невакцинированного поголовья сельскохозяйственных животных и контроля напряженности поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных. 2 табл., 6 пр.

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при клостридиозах животных, отличающийся тем, что эритроцитарный диагностикум изготавливают путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана смесью анатоксинов пяти штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е) в равных соотношениях, полученных из культуральной среды путем осаждения инактивированных формалином токсинов при температуре 37°С (анатоксинов) сульфатом аммония, и соматическими антигенами, полученными путем воздействия на штаммы Cl. perfringens №28, LD-1, №392, №213, №342 ультразвуком на дезинтеграторе при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 мин при температуре 4°С.