СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ ИНФЕКЦИОННЫХ И ДРУГИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1998 года по МПК C08F6/14 G01N33/531 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и пищевой промышленности, а конкретнее к способу получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных заболеваний онкологических, алкоголизма, наркомании и допинг-контроль.

В настоящее время для диагностики вирусных инфекций большое распространение получили так называемые непрямые реакции, основанные на методе активированных частиц. В качестве диагностикума в таких реакциях используют специфические антитела и антигены, фиксированные на поверхности неспецифических носителей органической или неорганической природы. Такими носителями чаще всего являются эритроциты, уголь, бентонитовые глины, содержащие белок A, синтетический латекс.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вирусных и менингококковых инфекций на основе латексного носителя [1]. В соответствии с этим способом 2%-ный синтетический латекс, содержащий функциональные группы, например, карбоксильные, альдегидные, или эпоксигруппы инкубируют в 0,1 М глициновом буфере при pH 7,0 - 8,2 в течение 2 ч при 37^oC до получения целевого продукта.

Получаемый диагностикум более стабилен, обладает более высокой активностью и специфичностью и дает возможность получения результатов исследования в более короткие сроки.

Наиболее близким является способ получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и других заболеваний, например антигенов HBsAg вируса гепатита B, согласно которому полистирольный латекс сенсибилизируют антителами в 0,1 М глициновом буфере, pH которого 7,0, а затем осуществляют инкубирование при температуре 37^oC в течение 2 - 8 ч. [2].

Диагностикум, полученный этим и вышеназванным способами позволяет выявить HBsAg вируса гепатита B только в концентрации 1 мкг/мл белка, ему свойственна достаточно высокая частота ложноположительных реакций (30 - 40%). Специфичность такого диагностикума выражается величиной (68,01 + 0,88). Кроме того, получаемый диагностикум позволяет получать результаты исследования через 20 мин.

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности к белкам и органическим веществам.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных заболеваний, включающем сенсибилизацию модифицированного полистирольного латекса при pH 7,0 и инкубирование сенсибилизированного латекса, используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и солей металла и ненасыщенной карбоновой кислоты при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 0,5, в качестве соли металла ненасыщенной карбоновой кислоты используют соли железа или кобальта и/или никеля. Оболочка составляет 0,2 - 20% от массы всей частицы.

Указанный латекс предварительно выдерживают в буфере при pH 6,5 - 9,0 в присутствии 0,5 - 0,7 мас.ч. органической гидроперекиси в течение 1 - 3 мес с последующей сенсибилизацией при pH 7,0 - 9,0 и инкубированием сначала при 37 - 56^oC в течение 80 - 300 мин, затем при 2 - 8^oC в течение 24 - 72 ч. Полученный диагностикум используют для определения HBSAg вируса гепатита B в концентрации 1 пг/мл, гепатита A в концентрации 1 пг/мл, антигенов онкологических заболеваний в концентрации 10 пг/мл, антигенов допинг-контроля и алкоголизма в концентрации 50 пг/мл, а также вируса СПИД в известной концентрации, содержащегося в сыворотке крови больных СПИД. Для диагностики используют сыворотку крови, или мочу, или слюну больного специфичность диагностикума 98,9 - 0,2. Получен комбинированный диагностикум к различным специфическим антигенам онкологических, инфекционных и других заболеваний.

Для диагностики антигенов и антител инфекционных и других заболеваний используется метод активирования частиц (МАЧ), заключающийся в том, что оценка результатов реакции проводится по степени активирования латексных частиц, визуально или оптическим прибором. Оценка результата МАЧ по степени активирования частиц следующая:
4+ - крупные хлопья активированных частиц на полностью прозрачном фоне, положительный результат;
3+ - крупны однородные зерна активированных частиц с небольшим количеством более мелких на слегка мутном фоне, положительный результат;
2+ - средних размеров зерна активированных частиц на мутном фоне, сомнительный результат;
1+ - мелкие активированные частицы, на мутном фоне, отрицательный результат;
- - мутный фон, частицы неактивированы, отрицательный результат.

Способ получения латекса типа ядро-оболочка и диагностикума иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. С целью получения полистирольного латекса в реактор загружают 10 мас. ч. стирола, 0,1 мас.ч. персульфата калия, 89,9 мас.ч. воды и реакционную смесь термостатируют при перемешивании при 70^oC до полной конверсии мономера. К части A полученного полистирольного латекса добавляют 1 мас.ч. метакрилата железа, 0,5 мас.ч. персульфата калия, 1,0 мас.ч. оксиэтилированного нонилфенола ОП-7. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов в течение 15 - 20 мин и термостатируют при 70^oC в течение 2 ч. Затем вводят 0,1 мас. ч. сульфата натрия, латекс охлаждают и отмывают диализом против 20 объемов дистиллата от водорастворимых примесей. Частицы латекса части A состоят из двух частей: внутреннее ядро - полистирол, наружная оболочка - сополимер стирола и метакрилата железа при массовом соотношении 1 : 0,3. Массовое соотношение между звеньями метакрилата железа и стирола, входящего в состав ядра и оболочки, составляет 0,297 - 100.

Затем латекс разводят глициновым буферным раствором до 2%-ной концентрации и смешивают в соотношении 1 : 1 с моноклональными антителами в буферном растворе при pH 7,0. Полученную смесь последовательно инкубируют в 0,01 М глициновом растворе при pH 7,0 в течение 80 мин при 37^oM, затем - 24 ч при 2^oC.

Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1 - 8.

Пример 2. Латекс получают по примеру 1, но используют 0,5 мас.ч. метакрилата железа, 0,5 мас.ч. сульфита натрия и 0,7 мас.ч. гидроперекиси ГПИПЦГБ.

10 мл 6%-ного латекса инкубируют в 1 М глицерино-глициновом буферном растворе pH 9,0 в течение 3 мес.

Затем концентрацию латекса доводят с помощью глицинового раствора до значения 2%, после чего смешивают равные объемы 2%-ного латекса и моноклонального антитела в 1 М глициновом буферном растворе при pH 9,0. Сенсибилизированный латекс затем инкубируют при pH 9,0 сначала в течение 5 ч при 56^oC, а затем при 8^oC в течение 72 ч.

Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1 - 8.

Для определения чувствительности диагностикума используют сыворотку больных СПИД, сыворотку крови беременных, антигены вируса гепатитов A и B и онкологических заболеваний.

Чувствительность комбинированных латексных антительных диагностикумов (ЛАД) приведена в табл. 7 и 5.

Примеры 3 и 4. Латекс и диагностикум получают по примеру 1, но используют 0,5 мас.ч. гидроперекиси п-ментана и третбутилизопропилбензола (ГПТБИПБ). Результаты диагностических исследований приведены в таблице 1.

Примеры 5 и 6. Латекс и диагностикум получают по примеру 1, но используют метакрилат кобальта или никеля. Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1.

Примеры 7 и 8. Латекс и диагностикум получают по примеру 1, но используют 0,3 мас.ч. акрилата железа и 0,3 мас.ч. итаконата железа.

Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1.

Пример 9. Латексы A и B получают по примеру 1, латексы A и B отдельно подвергают сенсибилизации и инкубированию по примеру 1, а затем смешивают. Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1.

Пример 10. Латекс и диагностикум получают по примеру 1, но используют 0,3 мас.ч. и метакрилата железа и 0,2 мас.ч. метакрилата кобальта. Результаты диагностических исследований приведены в таблице 1.

Пример 11.

Латекс и диагностикум получают по примеру 1, но используют 0,2 мас.ч. метакрилата железа и 0,3 мас.ч. метакрилата никеля. Результаты диагностических исследований приведены в таблице 1.

Использование: в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности для диагностики инфекционных и онкологических заболеваний, алкоголизма, наркомании, допинг-контроля, СПИД. Сущность изобретения: способ получения диагностикума, включающий сенсибилизацию латекса типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и соли железа и/или кобальта, и/или никеля ненасыщенной карбоновой кислоты при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 0,5, причем латекс предварительно выдерживают в буфере при рН 6,5 - 9,0 в присутствии перекиси, сенсибилизацию осуществляют при pH 7,0 - 9,0 и инкубируют сначала при 37 - 56^oС в течение 80 - 300 мин, затем при 2 - 8^oС в течение 24 - 72 ч. 8 табл.

Способ получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и других заболеваний, включающий сенсибилизацию полистирольного латекса антителами и антигенами в буферном растворе при рН 7 и инкубирование сенсибилизированного латекса, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности к белкам, используют латекс типа ядро - оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и соли железа, и/или кобальта, и/или никеля ненасыщенной карбоновой кислоты при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 0,5, причем указанный латекс предварительно выдерживают в буфере при 6,5 - 9,0 в присутствии 0,5 - 0,7 ч. от массы полимера органической гидроперекиси в течение 1 - 3 месяцев с последующей сенсибилизацией при рН 7 - 9 и инкубированном сначала при 37 - 56^oС в течение 80 - 300 мин, затем при 2 - 8^oС в течение 24 - 72 ч.