ДИАГНОСТИКУМ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНЫЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/543 A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для эпидемиологического надзора и для лабораторной диагностики легионеллеза.

Симптомы или сочетания симптомов, которые были бы специфичны исключительно для болезни легионеров, неизвестны. Правильный диагноз необходим для эффективного лечения и изучения легионеллезных вспышек. Поскольку лабораторные критерии являются основной частью определения случая болезни, методы лабораторной диагностики заслуживают особого внимания.

В настоящее время по-прежнему чаще всего применяются иммунохимические методы для определения титра специфических антител в крови человека. Конструирование таких систем включает создание диагностикумов. Известна реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), которая утверждена только для выявления антител к L.pneumophila cеpoгруппы 1 (1). Недостатком ее является невысокая специфичность и нестандартность.

Получение такого диагностикума во многом зависит от качества культуры, исследуемой как антиген. Следует отметить, что постановка данной реакции затруднительна из-за большого количества дополнительных реагентов.

Известна тест-система для определения антилегионеллезных антител в реакции микроагглютинации (2). Серологическим критерием диагностики является сероконверсия (4-х кратное или большее увеличение титра антител). Стойкий диагностический титр в микроагглютинации, который определяется как > 1:64, дает основание поставить диагноз легионеллеза. Такого рода препараты представляют собой суспензию убитых нагреванием микроорганизмов L. pneumophila, Philadelphia 1 (серогруппа 1) в концентрации по оптической плотности 0,23+2 при длине волны 530 нм. Способ приготовления такого диагностикума включает следующие этапы.

1. Выращивают L.pneumophila (штамм Philadelphia 1) на твердой питательной среде с гидролизатом рыбокостной муки в течение 72 часов при температуре +35^oC.

2. Выращенные клетки микроорганизма идентифицируют морфологически (микроскопирование) и иммунохимически (серотипирование).

3. На чашки с питательной средой добавляют по 3 мл стерильного забуференного физиологического раствора (ЗФР), pH 7,2. Делают смыв биомассы.

4. Собирают биомассу в стерильные флаконы и автоклавируют 1 час при температуре 101^oC.

5. Центрифугируют автоклавированную биомассу в течение 30 мин при 1600g.

6. К 0,1 мл осадка клеток добавляют 2 мл стерильного ЗФР, pH 7,2.

7. Доводят приготовленную суспензию бактериальных клеток (антиген) до концентрации 0,23+0,02, измеряемой по оптической плотности при длине волны 530 нм. Разбавление антигена осуществляют стерильным ЗФР, pH 6,4, содержащий 0,005% софранина. Хранят при температуре 4^oC.

Недостатком известного диагностикума является его низкая специфичность, обусловленная тем, что в качестве антигена используется целая клетка легионелл, на наружной мембране которой находятся антигенные эпитопы, общие с антигенными эпитопами других микроорганизмов таких как: F.tularensis, M.pneumoniae, Str. pneumoniae, H.influenza. Кроме того, данный диагностикум обладает низкой чувствительностью из-за того, что количество специфических антигенов на поверхности клеток меняется в зависимости от питательной среды, от условий культивирования, от генетической особенности клетки, от сезона и т. д. Недостатками микроагглютинационного диагностикума является также лабильность микробных клеток к воздействию экстремальных факторов и трудности при стабилизации и стандартизации диагностических препаратов.

Задача изобретения - повысить специфичность, чувствительность и стандартность диагностикума.

Для этого легионеллезный диагностикум содержит носитель и сенситин, в качестве носителя - окрашенный синим антрахиноновым жирорастворимый полистирольный латекс (ТОО "Диафарм", Санкт-Петербург) с активированными аминогруппами с размером частиц 0,804 мкм, с коэффициентом вариации 4,1-4,5% и коэффициентом дисперсии 1,003-1,006 и концентрацией аминогрупп 2,5 10⁴-10⁵ моль/г, а в качестве сенситина - белковую группоспецифическую фракцию поверхностных антигенов L.pneumophila, philodelphia (серогруппа 1) с мол.м. 45 кД.

Приготовление диагностикума проводят путем предварительной отмывки носителя, сенсибилизации, при этом латекс нагружают путем ковалентного связывания, затем проводят повторную отмывку диагностикума, причем предварительно отмытые частицы полистирольного латекса смешивают в концентрации 1% с раствором антигена, содержащим 150 мкг/мл белка и перед повторной отмывкой его обрабатывают глициновым буфером при pH 7,8 для инактивации оставшихся аминогрупп.

Получение белковой группоспецифической фракции М.м. 45кД.

1. Ферментация культуры L.pneumophila.

Рабочую культуру легионелл размораживают при комнатной температуре и засевают чашки Петри с твердой питательной средой. Выращивают при температуре (37±0,5)^oC в течение 3 суток. Биомассу легионелл (объем 1500 см³) инкубируют со 100 см³ 0,5 мг/см³ формалина в течение 1 ч.

2. Осаждение биомассы.

Осаждение биомассы проводят на центрифуге при 10000 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Отмывку биомассы проводят в физиологическом растворе pH 7,2 при 10000 g в течение 5 мин. Выход - 10 г - сырой вес биомассы (из объема 1500 см³).

3. Разрушение биомассы.

10 г биомассы суспендируют в 2000 см³ буферного раствора (ТРИС - 10 мг/см³; сернокислый магний - 10 мг/см³, pH 7,6). Порциями по 200 см³ суспензию обрабатывают с помощью ультразвукового дезинтегратора мощностью 60 Вт, пятикратно по 1 мин с интервалом по 2 мин. Осаждение неразрушенных клеток проводят путем центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Дезинтеграт подвергают ультрафильтрации под давлением азота в ячейках объемом 1000 см³ до конечного объема 200 см³. Концентрат разводят буфером (ТРИС - 10 мг/см³; сернокислый магний - 10 мг/см³, Тритон Х - 100 - 4%, pH 7,6) до объема 400 см³. Инкубируют 1 г при комнатной температуре с перемешиванием. Суспензию мембран осаждают центрифугированием при 50000 g в течение 1 ч при комнатной температуре. Выход фракции внешних мембран - 1 г влажного осадка.

4. Выделение белковой фракции с мол.массой 45 кД.

Фракцию внешних мембран суспендируют в 100 см³ буфера (ТРИС HCl - 50 мМ; ЭДТА - 0,1 мМ; Тритон Х-100 - 0,1%, pH 7,6) и инкубируют в течение 18 ч при температуре +10^oC с перемешиванием. Осаждение внешних мембран проводят центрифугированием при 50000 g в течение 1 ч. Выход - 200 мг белка в 100 мл буфера.

Комплекс белков внешних мембран фракционируют на ДЕАЕ - сефарозе. Элюцию проводят линейным градиентом 0,5%-1,5% 0,9% р-ра NaCl. Первая фракция содержит 20 мг белка с мол.массой 45 кД.

Белковый антиген должен соответствовать следующим требованиям:
pH белкового р-ра - 6,8 - 7,1;
электрофорез в 1 мг/см³ полиакриломидном геле - одна линия, соответствует белку с м.м. 45 кД.

реакция диффузной преципитации - одна линия преципитации с поливалентной кроличьей сывороткой.

Диагностикум готовят следующим образом.

1. 2 мл 1%-ной взвеси латексных частиц отмывают ЗФР pH 8 два раза, осадок латекса центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g.

2. К 2 мл 1%-ной взвеси латекса добавляют 2 мл антигена с концентрацией 150 мкг/мл по белку, после чего получается 4 мл 0,5%-ной взвеси латекса в растворе антигена с концентрацией 75 мкг/мл, которую инкубируют в течение 1 ч в термостате при 37^oC.

3. После инкубации частицы латекса центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g.

4. К осадку латекса добавляют 2 мл глицинового буфера pH 7,8 для блокирования оставшихся связей на частицах латекса. Инкубация латекса в глициновом буфере длится 1 ч в термостате при 37^oC.

5. После инкубации латекс центрифугируют в течение 20 мин при 400 g и отмывают фосфатным буфером pH 8. После этого готовят конечную концентрацию латекса 0,5% (4 мл). Хранят при 4^oC с добавлением азида натрия.

Пример использования
Приготовлено 3 вида диагностикумов.

1. Агглютинационный диагностикум на основе суспензии убитых нагреванием бактериальных клеток L.pneumophila, Philodelphia 1 (серогруппа 1) прототип.

2. Латексный диагностикум на основе комплекса поверхностных белковых антигенов L.pneumophila, Philodelphia 1 (серогруппа 1).

3. Латексный диагностикум на основе белковой группоспецифической фракции препарата поверхностных антигенов L.pneumophila, Philodelphia 1 (серогруппа 1). Первый тип диагностикума взаимодействовал с данной сывороткой в титре 1: 64, второй - 1:256, третий - 1:512. Это указывает на более высокую чувствительность латексного диагностикума, приготовленного на основе белковой фракции поверхностных антигенов с м.массой 45 кД.

Результаты опыта приведены в табл. 1.

На следующем этапе была исследована специфичность диагностикумов в реакции микроагглютинации.

С этой целью в пяти рядах панели раститровали реферансантисыворотки к L. pneumophila, Philodelphia 1 (серогруппа 1), Fr.tularensis, штамм 503, Mc. pneumo-niae, Str. pneumoniae, H.influenza тип b до разведения 1:2048. Из каждой лунки на предметное стекло внесли стандартное количество антител в объеме 0,02 мл, а затем к каждому объему антител добавляем соответствующий диагностикум в объеме 0,02 мл. После 2 мин инкубации в термостате учитывали реакцию по образованию видимого агглютината. Результаты опыта приведены в табл.2.

Из приведенных данных следует, что латексный диагностикум на основе белковой фракции поверхностных антигенов с мол.массой 45 кД образует агглютинаты только с антисывороткой к L.pneumophila, а диагностикум на основе суспензии убитых легионелл образует агглютинаты и с сыворотками к другим микроорганизмам.

Таким образом, показано, что белковая фракция поверхностных антигенов с мол.массой 45 кД является оптимальным сенситином для нагрузки носителя.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Control of legionellosis. Proposals for statutory action. London, Health and Safety Commission, 1989.

2. Эпидемиология, профилактика легионеллеза и борьба с ним: меморандум совещания ВОЗ. - Бюллетень ВОЗ, том 68, N 2, 1990, стр. 7.

Диагностикум предназначен для определения антител к легионеллам в сыворотке крови человека с целью диагностики легионеллеза. Диагностикум содержит носитель и сенситин. В качестве носителя диагностикум содержит окрашенный жирорастворимым синим атрахиноновым полистирольный латекс с активированными аминогруппами, с размером частиц 0,804 мкм, коэффициентом вариации 4,1-4,5%, коэффициентом дисперсии 1,003-1,006 и концентрацией аминогрупп 2,5 x 10⁴-10⁵моль/г. В качестве сенситина диагностикум содержит белковую группоспецифическую фракцию с мол.м. 45 кД антигенов наружной мембраны L.pneumophila Philodelphia 1 (серогруппа 1). Для получения указанного диагностикума 1%-ную взвесь предварительно отмытых частиц используемого в качестве носителя полистирольного латекса инкубируют с раствором используемой в качестве сенситина белковой группоспецифической фракции с концентрацией белка 150 мкг/мл при объемном соотношении 1:1. После инкубации частицы латекса обрабатывают глициновым буфером с pH 7,8 и повторно инкубируют. Полученный диагностикум представляет собой 0,5%-ную взвесь частиц латекса, ковалентно связанных с белковой группоспецифической фракцией. Диагностикум может быть использован для лабораторной диагностики легионеллеза, обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.

1. Диагностикум легионеллезный на основе L.pneumophila Philodelelpia 1 (серогруппа 1), отличающийся тем, что он содержит носитель и сенситин, при этом в качестве носителя диагностикум содержит окрашенный жирорастворимым синим атрахиноновым полистирольный латекс с активированными аминогруппами, с размером частиц 0,804 мкм, коэффициентом вариации 4,1 - 4,5%, коэффициентом дисперсии 1,003 - 1,006 и концентрацией аминогрупп 2,5 • 10⁴ - 10⁵ моль/г, в качестве сенситина диагностикум содержит белковую группоспецифическую фракцию с мол. м. 45 кД антигенов наружной мембраны L.pneumophila Philodelphia 1 (серогруппа 1) и указанный диагностикум представляет собой 0,5%-ная взвесь частиц латекса, ковалентно связанных с белковой группоспецифической фракцией. 2. Способ получения диагностикума легионеллезного на основе L.pneumophila Philodelphia 1 (серогруппа 1), отличающийся тем, что 1%-ная взвесь предварительно отмытых частиц используемого в качестве носителя окрашенного жирорастворимым синим атрахиноновым полистирольного латекса с активированными аминогруппами, с размером частиц 0,804 мкм, коэффициентом вариации 4,1 - 4,5%, коэффициентом дисперсии 1,003 - 1,006 и концентрацией аминогрупп 2,5 • 10⁴ - 10⁵ моль/г смешивают с раствором используемой в качестве сенситина белковой групппоспецифической фракции с мол.м. 45 кД антигенов наружной мембраны L. pneumophila Philodelphia 1 (серогруппа 1) с концентрацией белка 150 мкл/мл при их объемном соотношении 1 : 1, после инкубации частицы латекса обрабатывают глициновым буфером с рН 7,8 и повторно инкубируют с получением диагностикума в виде 0,5%-ной взвеси частиц латекса, ковалентно связанных с белковой группоспецифической фракцией.