СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики инфекционных болезней.

Диагностика иерсиниоза в связи с его клиническим полиморфизмом трудна. Это заболевание может иметь сходную клиническую картину с острым гепатитом, ревматизмом, аппендицитом, болезнью Крона, острым гастроэнтероколитом, нодозной эритемой и т.д. Поэтому при иерсиниозе нередки диагностические ошибки и только соответствующая эпидобстановка может в определенной степени ориентировать клинициста. Из этого следует, что ведущей в распознавании данной инфекции является лабораторная диагностика.

В соответствии с инструктивными документами [1] большое значение уделяется серологическим методам диагностики. Результаты исследования крови больных на наличие антител к определенному виду возбудителя позволяют ориентировать клинициста в тактике ведения больного и в определенной степени прогнозировать течение заболевания. Если для лечащего врача достаточно определения вида возбудителя, то для эпидемиолога представляет интерес уточнение серовара иерсинии. Поэтому серологические исследования проводят поэтапно. Вначале ставят ориентировочную реакцию с типовыми диагностикумами. При этом определяют род микроорганизма, к которому в крови имеются антитела. При выявлении антител к иерсиниям ставят развернутую реакцию с диагностикумами к наиболее часто встречающимся сероварам 0-9 и 0-3, затем, если возникнет в этом необходимость, с диагностикумами к сероварам 0-5,27, 0-8, 0-6 и т.д. Таким образом, общепринятая схема серологической диагностики иерсиниоза многоэтапна, трудоемка и длительна.

Для ее реализации используют бактериальные диагностикумы [1] работа с которыми предусматривает объемную постановку реакции агглютинации в пробирках. Более простым и чувствительным является способ, основанный на реакции непрямой гемагглютинации, взятый нами за прототип. В качестве диагностикума в данном случае используют эритроциты барана, нагруженные антигеном соответствующего вида или серовара иерсиний. Реакция при этом выполняется в планшетах в микроварианте. Схема исследования остается той же, что и в аналоге. Поэтому так же, как и аналог, способ многоэтапный. Впервые такой способ диагностики псевдотуберкулеза предложил M.Crunpton в 1958 г. [2]
Усовершенствование эритроцитарных диагностикумов позволило добиться их относительной стандартности и освоить промышленный выпуск [3, 4]
С целью повышения стандартности диагностикумов были сделаны попытки применить вместо эритроцитов синтетические носители [5-10] Наибольшее распространение при этом получили полистирольные латексы. Иммобилизация антигенов при этом производилась на них путем физических сорбций [5,7,8,10] Некоторые авторы предлагали ковалентную привязку антигена через активные функциональные группы, введенные в полистирол [6, 9] Кроме того, такие носители удалось маркировать красителем. Последнее открыло перспективу конструирования диагностических наборов, в которых каждый из включенных диагностикумов имел бы цветную метку в зависимости от специфичности. Такое техническое решение не могло быть реализовано ранее при использовании естественных носителей (эритроцитов).

Парфеновой Е.В. и соавт. [11] был получен антигенный диагностикум к дрожжеподобным грибам рода Candida на основе полистирольного латекса с активными аминогруппами, окрашенного антрохиноновым синим. Авторами использован такой диагностикум для определения антигена грибов в реакции нейтрализации антител по эффекту блокирования агглютинации частиц латекса. При этом для учета реакции цветовой маркер не имел принципиального значения. Этот диагностикум мог выявлять только один вид антител.

Целью настоящего изобретения является сокращения этапности серодиагностики иерсиниоза. Поставленная цель достигается тем, что в ряд последовательных разведений сыворотки больного добавляют комплексный латексный диагностикум, состоящий из полистирольных микросфер, окрашенных различными красителями, соответствующими определенной специфичности иммобилизованных на них иерсиниозных антигенов путем ковалентной сшивки через поверхностные эпоксигруппы, а учет реакции осуществляют по цвету выпавшего в виде "пуговки" латекса и сформировавшегося в виде зонтика агглютината.

Способ осуществляется следующим образом. Готовят диагностикум, специфичный к J.enterocolitica серовара 0-9. 2 мл 1% взвеси полистирольных микросфер, окрашенных в желтый цвет, имеющих на поверхности активные эпоксигруппы, двукратно отмывают забуференным физиологическим раствором pH 8,0. К 2 мл отмытой взвеси добавляют 2 мл О-антигена, содержащего фактор 03 в дозе 25 мкг/мл и инкубируют 1 час при 37^oC. Латекс отмывают трижды тем же раствором. Добавляют 2 мл глицинового буфера pH 7,8 и инкубируют 1 час при 37^oC. Дважды отмывают физиологическим раствором pH 8 и доводят до конечной концентрации 1% Аналогичным способом готовят диагностикум синего цвета с нагрузкой иерсиниозным антигеном серовара 03. Латексные диагностикумы разных цветов и соответствующей специфичности смешивают в равных объемах. Необходимо учесть, что при смешивании диагностикумов разных цветов происходит разбавление исходной взвеси каждого из них в два раза. Конечная концентрация частиц, меченных одним красителем, не должна быть ниже 0,05% Приготовленная смесь зеленого цвета представляет собой комплексный диагностикум и может сохраняться при 4^oC до года. В микропланшетах для иммунологических реакций готовят ряд последовательных разведений сыворотки крови больного в объеме 25 мкл. В качестве растворителя используют разведенную 1:100 нормальную сыворотку кролика. Во все лунки ряда добавляют в объеме 25 мкл комплексный антигенный иерсиниозный диагностикум. Через 18 часов учитывают реакцию. Если в сыворотке имеются антитела к одному фактору О-антигена иерсиний, то образовавшийся агглютинат выпадает в виде зонтика того цвета, которым маркирован взаимодействующий диагностикум. Цвет выпавшего при этом латекса, не включенного в агглютинат, отличается от цвета комплексного препарата, т.е. наблюдается выпадение цвета реагирующего компонента смеси.

Пример конкретного использования. По описанной методике приготовлены латексный диагностикум J.enterocolitica к фактору 3 желтого цвета и фактору 9 синего цвета. Смесь 1% взвесей каждого вида диагностикумов была зеленого цвета.

При добавлении в ряд раститрованной гомологичной сыворотки каждого вида гомологического однофакторного диагностикума, маркированного соответствующим красителем, образуется агглютинат до титра сыворотки в виде зонтика.

При раститровке сыворотки к фактору 3 и добавлении комплексного диагностикума зеленого цвета образуется агглютинат синего цвета до титра сыворотки, а неагглютинирующие частицы, содержащие фактор 9, выпадают в виде "пуговки" желтого цвета. При высоких разведениях сыворотки (выше титра) выпадают в виде пуговки частицы желтого и синего цвета. При этом осадок окрашен в зеленый цвет. Обратный эффект наблюдается при титровании сыворотки к фактору 9. В случае, если сыворотка имеет антитела к обоим факторам, но в разных титрах, наблюдается выпадение зеленого цвета агглютината до титра перекрестной реакции. Преобладание активности этой сыворотки по одному из антигенов проявляется так же, как и в предыдущем случае.

Традиционная серодиагностика иерсиниоза многоэтапна. Включает определение в сыворотке крови больного антител к роду иерсиний, определение антител к виду иерсиний и, далее, к серотину. Это требует использования набора антигенных диагностикумов и оттитровки сыворотки больного по каждому из диагностикумов, входящих в комплект. Предлагаемый способ одноэтапный и включает одну раститровку сыворотки.

Предложено впервые реакцию агглютинационного типа учитывать по цвету образовавшегося агглютината и вычленению определенного цвета вступающих в реакцию частиц из смеси.

Источники информации
1. Иерсиниоз. Методические рекомендации по эпидемиологии, клинике, диагностике, лечению и профилактике. МЗ СССР, четвертое Главное управление. 1985, с.25.

2. Crumpton M. Davies D. Hutchison J. The serological specificities of Pasteurella pseudotuberculosis somatic antigen. J. gen.Microbiol. 1958, 18, p. 129-139.

3. Королюк А.М. Панин А.Л. Опыт приготовления эритроцитарного препарата для серодиагностики иерсиниоза. Вопросы серологической диагностики. 1979, с. 56-59.

4. Королюк А.М. и др. Серодиагностика кишечного иерсиниоза. ЖМЭИ N 3, с. 30-33.

5. Александер С.К. Лукин Ю.В. Фидлер Л.М. Приготовление Ig G диагностикума на основе окрашенных пролиакролеиновых латексов для применения в реакции латексной агглютинации. ЖМЭИ N 6, 1990, с.84-88.

6.Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. Под ред. Т.В.Перадзе и П.Халонена. М.мед. 1985, с.121-143.

7. Чайка Н.А. Реакция агглютинации латекса. В кн. Серологическая диагностика паразитарных болезней. М. ВНИИМИ, 1982, с.14-25.

8.Bangs J.B. Uniform latex particles. Indianapolis, 1986, 67 p.

9. Hopwood V. Evans E.G.V. A comparision of methods for the detection of Candida antigens evaluation of a new latex reagent. J.Immunol.Metods. 1985, V.80, p.199-210.

10. Price M.F. Jentry J.O. Incidens and significatnce of Candida antigen in low-risk and high-risk patient papulations.Eur. J.Clin.Microbiol. 1986. V.5. N 4, p.416-419.

11. Парфенова Е.В. и соавт. Диагностикум для определения паприна и способ его приготовления. Заявка N 5018064/14 (081689) от 24.12.1991.

Использование: в области медицины, а именно в иммунологии, и может применяться для диагностики инфекционных болезней. Сущность изобретения: в ряд последовательных разведений сыворотки больного добавляют комплексный латексный диагностикум, состоящий из полистирольных микросфер, окрашенных различными красителями, соответствующими определенной специфичности иммобилизованных на них иерсиниозных антигенов путем ковалентной сшивки через поверхностные эпоксигруппы, а учет реакции осуществляют по цвету выпавшего в виде "пуговки" латекса и сформировавшегося в виде "зонтика" агглютината. Способ позволяет сократить время исследования за счет сокращения этапности серодиагностики иерсиниоза.

Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза, включающий то, что в ряд последовательных разведений сыворотки крови больного добавляют антигенный диагностикум с последующим учетом реакции гемагглютинации, отличающийся тем, что используют смесь серотипических маркированных по цвету диагностикумов, каждый из которых представляет собой латексный окрашенный в контрастный цвет носитель, на котором иммобилизованы посредством ковалентной связи через эпоксигруппы иерсиниозные О-антигены различных серотипов, а диагностику осуществляют по цвету осадка, выпавшего в виде "пуговки", и по цвету агглютината, сформировавшегося в виде "зонтика" с дифференциацией серотипа возбудителя иерсиниоза по маркирующему серотип цвету.