СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ ИЗ ТРУДНОПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН Российский патент 1998 года по МПК A01H4/00 A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а более конкретно к культивированию in vitro, выделенных из семян зародышей и может быть использовано для размножения сортов и видов растений с плохо прорастающими семенами. Кроме размножения растений, одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции для выращивания сеянцев из семян с недоразвитыми зародышем и эндоспермом, для отбора устойчивых генотипов на уровне зародышей.

Известно изобретение "Питательная среда для культивирования зародышей косточковых культур", включающее выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений (а. с. СССР N 1261587, 1986). Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. Питательная среда не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, так как для различных стадий развития зародышей требуется присутствие в среде разных регуляторов роста.

Известен "Способ определения солеустойчивости растений", включающий выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и получение из них растений (а.с. СССР N 1166745, 1985). Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном контакте зародышей с питательной средой. В способе выращивают растения из семян, полученных при скрещивании различных исходных форм. Но при скрещивании, например, диких видов, обладающих солеустойчивостью с культурными сортами, которые недостаточно совместимы на биохимическом уровне, образуются труднопрорастающие семена с недоразвитыми зародышами. Для получения растений из семян с недостаточно зрелыми зародышами требуется последовательное добавление в среды разных регуляторов роста, которые будут индуцировать прохождение зародышами стадий их развития вплоть до образования побегов.

Известен "Способ выращивания растений подсолнечника in vitro", включающий выделение из семян зародышей, культивирование из на питательной среде in vitro и выращивание из них растений (прототип, а.с. СССР N 810160, 1981). Но выделение зародышей из семян способом прототипа требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. В способе прототипа не изменяют последовательно состав регулятора роста в питательной среде, что не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, находящихся на глобулярной, сердцевидной или торпедовидной стадиях развития. Кроме того, у зародышей может быть нарушен баланс эндогенных фитогормонов. Поэтому для образования семядолей у торпедовидных эмбриоидов, последующего развития гипокотилей и побегов необходимо применение питательных сред с различным содержанием экзогенных регуляторов роста.

В основу изобретения поставлена задача увеличения выхода растений из зиготических зародышей, культивируемых на питательной среде in vitro и сокращения затрат труда на выращивание растений из труднопрорастающих семян. Поставленная задача решается тем, что согласно предлагаемому нами изобретению вводится культивирование зародышей с частью оболочки семени, полученных путем поперечной разрезки семян или культивирование семян с раздавленной оболочкой без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Необходимые затраты труда на поперечный разрез семян или частичное раздавливание их оболочки намного меньше, чем на выделение зародышей под бинокулярным микроскопом (способ прототипа). Часть оболочки семени с прилегающими к зародышу тканями защищает зародыш от резкого воздействия питательной среды, что способствует постепенной его адаптации. Питательная среда постепенно проникает к зародышу через разрез семени или в местах повреждения оболочки при раздавливании семени (в обоих случаях со стороны эндосперма), что моделирует естественный путь питания зародыша. Поэтому увеличивается процент выхода растений из высаженных зародышей. Перед высадкой на питательную среду зародыша с частью оболочки семени определяют стадию его развития в семенах различных сортов и видов растений. Недоразвитые зародыши с частями оболочек семян последовательно пересаживают для каждой следующей стадии их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. Для формирования сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных из сердцевидных - β -индолилуксусную кислоту ( β -ИУК). Для развития семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6-БАП. Для получения гипокотилия у торпедовидных эмбрионов - гибберелловую кислоту (ГАЗ). Для развития побегов у проростков - 6-БАП. Зародыши с частями оболочек семян культивируют в жидкой питательной среде, что ускоряет их развитие и дает возможность легко менять состав среды (зародыши с частями оболочек семян оседают на дно культурального сосуда, питательную среду сливают и наливают новую). В случае недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет его функции. Культивирование зародышей с частями оболочек семян, полученных за счет поперечной разрезки или частичного раздавливания семян позволяет снизить затраты труда, так как эти операции более просты и требуют меньшей квалификации сотрудников по сравнению с вычислением зародышей из семян.

На фиг. 1 (а и б) схематично показан поперечный разрез семени на две части: с зародышем и без зародыша; на фиг. 2 - прорастание семядолей зародыша через поперечный разрез семени, развитие корня и побега; на фиг. 3 представлено развитие семядолей и гипокотиля проростков из зародышей винограда в жидкой среде: на фиг. 4 (а и б) - проростки винограда высажены на агаризованную среду для развития побегов; на фиг. 5 (а и б) - развитие побегов и растений с корнями на агаризованной среде.

Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, например, некоторых сортов винограда, которые содержат рудименты семян, или из быстро теряющих всхожесть семян полыни лимонной (Artemisia balchanorum Krasch. , всхожесть через год от момента сбора приближается к 0 - 1%), или из труднопрорастающих семян секвойядендрона гигантского (Sequojadendron giganteum Lindl. , в естественных условиях всхожесть 1 - 2%, в лаборатории - 10%), фисташки туполистной (Pistacia mutica Fich et May, в естественных условиях всхожесть меньше 1%, в лаборатории - 9%) осуществляют следующим образом.

Семена подвергают поверхностной стерилизации. В стерильных условиях делают поперечный разрез семени (фиг. 1) на две части: на часть семени с зародышем 1 и на часть семени без зародыша 2. Поперечный разрез семени делают в такой плоскости A, которая исключает повреждение зародыша 3. Части семян 1, с находящимися в них зародышами 3, в стерильных условиях высаживают на агаризованную или в жидкую среду и культивируют in vitro до развития сеянцев (фиг. 2). Через разрез в части семени с зародышем проникает питательная среда. В случае дефектности семян из-за недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет функции эндосперма и способствует развитию зародышей, а в случае недоразвитости зародышей в семенах регуляторы роста, находящиеся в среде, способствуют созреванию зародышей и взвывают развитие проростков (сеянцев).

У видов растений с мелкими семенами, например, Artemicia balchanorum трудно сделать поперечный разрез семени. Для таких видов может применяться раздавливание оболочки семян без повреждения или с частичным повреждением зародыша.

Кроме размножения растений одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции растений. Так, например, при выведении новых бессемянных сортов винограда в ягодах образуются недоразвитые семена, которые к моменту созревания ягод атрофируются. При выведении устойчивых к милдью, оидиуму, серой гнили, филлоксере сортов винограда делают скрещивание устойчивого винограда Vitis rotundifolia, с неустойчивыми, но с хорошим качеством урожая сортами Vitis vinifera, с последующим насыщающими скрещиваниями. Однако при таких скрещиваниях образуются недоразвитые, непрорастающие семена. Из таких семян получают растения культивированием изолированных зародышей на питательной среде in vitro. Выделение зародышей - очень трудоемкий процесс, что делает массовое выращивание сеянцев практически невозможным. Предлагаемый нами способ позволяет высаживать на питательные среды большое количество зародышей с частью оболочки семени. Кроме того, оболочка семени обеспечивает постепенную адаптацию зародышей к питательной среде, что увеличивает процент их приживаемости. Частным случаем использования предлагаемого способа в селекции растений является его применение для отбора генотипов на уровне зародышей. Отрезанные части семян с зародышами, с целью отбора устойчивых генотипов к селективному фактору высаживают на среды, содержащие, например, повышенную концентрацию NaCl (солеустойчивость), маннит (засухоустойчивость), токсины патогенов (устойчивость к грибным болезням), гербициды (устойчивость к гербицидам) и т.д. Концентрации селективных факторов подбирают путем культивирования зародышей с частями оболочек семян устойчивых сортов или отбирают единичные, развивающиеся сеянцы, генотипы которых оказались устойчивы к селективному фактору, при ингибировании прорастания большинства зародышей. При применении предлагаемого нами способа (фиг. 2) гипокотиль 4 с семядолями 5 прорастает через поперечный разрез семени. Из "носика" семени вырастает корешок 6. После прорастания семядолей развивается побег 7.

Пример. Берут зеленые ягоды от растений винограда через 20 - 75 дней после оплодотворения, моют в мыльной воде, промывают от мыльной воды. Ягоды стерилизуют 40 сек 90%-ным этиловым спиртом, затем 8 мин 0,1%-ным диоцидом или 10 мин 5%-ным гипохлоритом натрия и промывают стерильной дистиллированной водой 3 - 4 раза на протяжении 10 мин. В стерильных условиях из ягод выделяют семена, промывают в стерильной дистиллированной воде и производят поперечный разрез семян. В случае использования вызревших семян из зрелых ягод операции по стерилизации производят непосредственно с семенами. Предварительно определяют стадии развития зародышей в семенах, рассматривая их под бинокулярной лупой (глобулярная, сердцевидная, торпедовидная или с развитыми семядолями). Части семян с зародышами высаживают в жидкую среду таким образом, чтобы они или по крайней мере место среза были погружены в питательную среду (фиг. 2), содержащую минеральные элементы Nitsch, Nitsch (1969) (в мг/л): 950 KNO₃; 720 NH₄NO₃; 185 MgSO₄ • 7H₂O; 166 CaCl₂; 85 KH₂PO₄, 28 FeSO₄ • 7H₂O; 37 Na₂ ЭДТА • 2H₂O; 25 MnSO₄ • 4H₂O; 10 H₃BO₃; 10 ZnSO₄ • 7H₂O; 0,25 Na₂MoO₄ • 2H₂O; 0,025 CuSO₄ • 5H₂O; витамины: 0,5 никотиновой кислоты, 5,5 пиридоксина-HCl, 5,5 тиамина-HCl; 100 мезо-инозита; 20000 сахарозы; 7000 агар-агара (для агаризованной среды). pH устанавливают перед автоклавированием на значении 5, 6. В зависимости от того, на какой стадии находятся зародыши в среду добавляют необходимые для их дальнейшего развития регуляторы роста. Затем последовательно осуществляют пересадки этих зародышей с частями оболочек семян для прохождения ими каждой последующей стадии своего развития. Глобулярные зародыши высаживают в жидкую среду с цитокинином 6-бензиламинопуурином (6-БАП) в концентрации 0,5 мг/л. Образующиеся на этой среде через 10 - 15 дней сердцевидные зародыши пересаживают в жидкую среду с β -индолилуксусной кислотой ( β -ИУК) (0,1 мг/л). Формирующиеся затем через 15 - 20 дней торпедовидные зародыши для развития семядолей помещают в жидкую среду с 6-БАП (0,5 мг/л) и культивируют при освещенности 1000 - 3000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 25 - 27^oC. Через 20 - 30 дней развиваются проростки с зелеными семядолями, гипокотилями и в нижней части с белым зачаточным корешком (фиг. 3). Проростки, развившиеся в жидкой среде, в большинстве случаев освобождаются от оболочек семян (выходят через разрезы семян) и плавают отдельно. Хотя иногда можно увидеть и проростки с частями оболочек семян (фиг. 3, на проростке, находящемся с правой стороны, сохранилась часть оболочки семени, от которой его легко можно освободить пинцетом). Далее, проростки высаживают на агаризованную среду с 0,2 - 0,5 мг/л 6-БАП для развития побегов (фиг. 4а). Так, у проростка, находящегося в стакане с правой стороны, начал развиваться побег (фиг. 4а). В случае слабого развития гипокотиля проростки высаживают в жидкую или на агаризованную среду с гибберелловой кислотой (ГА₃) в концентрации 0,5 - 2 мг/л (ГА₃ добавляют в среду перед автоклавированием) (фиг. 4б), а затем пересаживают на агаризованную среду с 0,2 - 0,5 мг/л 6-БАП. Через 30 - 40 дней у проростков развиваются побеги (фиг. 5а). Побеги черенкуют на одноглазковые экспланты, содержащие лист, пазушную почку и части междоузлий с обеих сторон узла и высаживают на среду без регуляторов роста следующего состава (Зленко, Трошин, 1993), в мг/л: 308 NH₄NO₃; 922 KNO₃; 597 MgSO₄ • 7H₂O; 122 KH₂PO₄; 331 CaCl₂; Fe - хеллат по Мурасиге, Скугу (1962): 28 FeSO₄ • 7H₂O; 37 Na₂ ЭДТА; микроэлементы по Мурасиге, Скугу (1962): 22,3 MnSO₄ • 4H₂O; 6,2 H₃BO₃; 8,6 ZnSO₄ • 7H₂O; 0,25 Na₂MoO₄ • 2H₂O; 0,025 CuSO₄ • 5H₂O; 0,025 CoCl₂ • 6H₂O; 0,83 KJ; витамины: 20 мезо-инозита, 0,1 тиамина-HCl, 0,2 пиридоксина-HCl, 0,5 никотиновой кислоты; другие добавки: 1 феррулловой кислоты, 10000 сахарозы, 7000 агар-агара (для агаризованной среды). pH до автоклавирования среды - 5,6. Через 30 - 40 дней из одноглазковых эксплантов с листьями вырастают растения с хорошо развитой корневой системой (фиг. 5б).

Перед высадкой на адаптацию растения-сеянцы культивируют в объемных лабораторных сосудах (например, химических стаканах на 150 мл) с диаметром горлышка не менее 4 см. После 2 - 4 недель культивирования крышки из фольги заменяют на целлофановые (где целлофановая пленка прижата резиновым кольцом) и культивируют еще 2 - 3 недели. Через целлофановую пленку происходит газообмен и растения адаптируются к пониженной влажности, процессам дыхания и фотосинтеза. Полученные сеянцы пересаживают в теплицу и первые 20 - 30 дней их притеняют от попадания прямых солнечных лучей.

При высадке растений-сеянцев винограда в теплицу в июле-августе до конца вегетации не вырастают стандартные саженцы (длина вызревшей лозы не меньше 50 см), в то время как при высадке в марте-мае к концу вегетации вырастают саженцы, пригодные для высадки на постоянное место в поле для агробиологического излучения и выделения сеянцев - кандидатов в новые сорта.

Применение предлагаемого способа (таблица) позволит значительно сократить затраты труда, а также увеличить выход растений при выращивании их из труднопроизрастающих семян путем культивирования зародышей по вышеуказанной схеме.

Источники информации:
1. А.с. СССР N 810160, кл. A 01 H 1/04, 1981.

2. А.с. СССР N 1166745, кл. A 01 H 1/04, 1985.

3. А.с. СССР N 1261587, кл. A 01 H 3/00, 1986.

4. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant., 1962. - V. 15. - p. 473 - 497.

5. Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science, 1969. - V. 163. - N 3862. - p. 85 - 87.

6. Зленко В. А. , Трошин Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27. - N 3. - с. 53 - 63.

Способ предназначен для культивирования in vitro выделенных из семян зародышей и может быть использован для размножения видов растений с плохо прорастающими семенами. Семена разрезают в плоскости поперечного их сечения без повреждения зародыша, или оболочку семени раздавливают без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Затем подготовленные таким образом семена культивируют в жидкой или на агаризованной среде in vitro. При культивировании их последовательно пересаживают для дальнейшего их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

1. Способ выращивания растений труднопрорастающих семян, включающий культивирование зародышей в (на) питательной среде in vitro, отличающийся тем, что семена разрезают в плоскости их поперечного сечения без повреждения зародыша и часть семени с зародышем высаживают на питательную среду, а у сортов и видов растений с мелкими семенами оболочку семени раздавливают без повреждения или с частичным повреждением зародыша и высаживают in vitro, при этом недоразвитые зародыши с частью оболочки семени последовательно пересаживают для дальнейшего их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для культивирования зародышей с частью оболочки семени в питательную среду добавляют регуляторы роста в зависимости от стадии развития зародышей и осуществляют дальнейшие пересадки для получения каждой последующей стадии и в конечном итоге - растений; для развития сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6 - бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных зародышей из сердцевидных - бета - индолилуксусную кислоту, для формирования семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6 - БАП, для получения гипокотилей у проростков - гибберелловую кислоту (ГА₃), для развития побегов у проростков - 6 - БАП.