Способ получения растений-регенерантов чая Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и семеноводстве ( в частности, в работе по созданию искусственных семян), в исследованиях по физиологии, эмбриологии и морфогенезу растений.

Цель изобретения - ускорение получения регенерантов и повышение их выхода.

Способ состоит в том, что недозрелые коробочки с семенами чая стерилизуют путем погружения на 3-5 с в 96° этиловый спирт с последующим обжиганием в пламени спиртовки, в асептических условиях проводят снятие наружных покровов с семени, вырезают половой зародыш, каждую семядолю разрезают на четыре фрагмента и помещают на искусственную агаризован- ную питательную среду (0,5-0,6%-ныйагао), содержащую макро- и микроэлементы по прописи Гамборга Вб и дополненную б-бен- -зиламинопурином (2 мкмоль) и а-нафтилук- сусной кислотой (10 мкмоль). Культуральные сосуды с эксплантатами помещают в услоемя темноты и инкубируют при 25±1°С в течение 15 сут. затем переносят в условия освещения: освещенность 2-4 лк, фотопериод 16/8 ч, температура та же. Через 30-40 сут из эксплантата развиг,ается быстрорастущая змбриогенная каллусная масса. Помещая эмбриогенный каллус на ту же среду, но с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста, через 15-20 сут наблюдают образование соматических эм- бриоидов, которые в процессе своего развития проходят все стадии, присущие развитию зиготических зародышей: глобулярную, сердечковидную торпедовидную и семядольную. Змбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга Bs, дополненную 1 мкмоль 6-бензиламинопурина и 5 мкмоль ft -индолилмаслячой кислоты, культивируют в тех же условиях освещения. Наблюдают развитие у соматических эмб- риоидов корней и побегов. Через 30-35 сут образуются проростки чайных растений, которые переносят в почву.

За один цикл выращивания из эмбрио- генного каллуса, полученного от одного фрагмента семядоли, формируется 30-50 соматических эмбриоидов, 80-90% которых последовательно развивается в растения. С целью увеличения коэффициента размножения участки семядоль от соматических змбриоидов повторно культивируют при тех же условиях, получая каллуснуго массу, а затем и соматические эмбриоиды, развива.- ющиеся в растения,

П р и м е р 1. Зеленые коробочки с недозрелыми семенами чая сорта Грузинский № 2 подвергают поверхностной стерилизации, погружая их в 96° этиловый спирт, обжигают в пламени спиртовки. Такой прием поверхностной стерилизации позволяет получить 100%-ный выход неинфицированного материала при 100-ном сохранении его жизнеспособности, В асептических условиях удаляют с семян наружные покровы, извлекают семена и вырезают половой зародыш, каждую семядолю делят на четыре фрагмента и эти фрагменты помещают на агаризованнуга среду Гамборга Вб, до- полненную сахарозой (3%) витаминами: ни- отиновой кислотой 1 мг/л, тиаминам 10 мг/л, пиридоксином 1 мг/л, мезоинозитом 100 мг/л; 6-бензиламинопурином 1-20 мкмоль, а-наф- тилуксусной кислотой 2-20 мкмоль. рН среды до автоклавирования доводят до 5,8-5,9. Условия культивирования: инкубирование эксплантатов в первые 15 сут в темноте при 25±1°С, а затем в условиях освещения при 2-4 лк, фотопериоде 16/8 ч. Более длительное пребывание эксплантатов в условиях темноты приводит к частичной потере эмбриогенного потенциала каллуса, а при помещении эксплантатов сразу в условия освещения полностью ингибируется развитие эмбриогенного каллуса.

Дальнейшее развитие соматических эмбриоидов происходит более синхронно и за меньший промежуток времени на среде с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста.

Соматические эмбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга Bs, дополненную 1 мкмоль 6-бензиламинопурина и 5 мкмоль /J-индолилмасляной кислоты. Использование полного состава среды Гамборга Bs приводит к опережению роста и развития побега над корнем, кроме того, корень растет в основном в длину и не формирует боковых ответвлений.

Растения-регенеранты переносят в почву, укрывают в течение 15-20 дней полиэтиленовой пленкой, а после этого выращивают в обычных условиях.

Примеры2иЗ, Способ осуществляют аналогично примеру 1, отличие состоит в том, что действие подтверждается исследованиями на других сортах чая, а именно Колхида и Китайская крупнолистная форма.

Влияние концентрации регуляторов роста в индуктивной среде Гамборга ВБ -:а характер ответа эксплантатов (при п - 40) представлено в табл. 1, влияние концентрации регуляторов роста на темп развития соматических эмбриоидов до семядольной стадии - в табл. 2, влияние концентрации регуляторов роста в 1 /2 состава среды Гамборга Bs на характер формирования проростков чайного растения из соматических

эмбриоидов на семядольной стадии развития - в табл, 3.

Формула изобретения Способ получения растений-регенерантов чая, включающий введение эксплантатов в культуру, культивирование на питательной среде с последующим получением регенерантов, отличающийся тем, что, с целью ускорения получения регенерантов и повышения их выхода, к качестве эксплантатов используют семядоли из недозрелых семян, культивирование осуществляют на модифицированной среде Гамборга Bs, в которую вносят 2 ммоль б-БАП и

10 ммоль а-НУК, при следующих режимах: первые 15 сут его проводят в темноте, далее культивирование осуществляют ка саету для индуцирования эмбриогенного каллуса, который помещают на ту же среду с уменьшенной вдвое концентрацией используемых регуляторов роста для получения соматических змбриоидов до семядольной стадии развития, после чего их переносят на среду Гамборга Bs с уменьшенной адоое

концентрацией минеральных солей, в которую дополнительно вводят 1 ммоль 8-БАП и 5 ммоль fi -ИМК.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться для ускоренного получения большого количества растений чая. Целью изобретения является ускорение получения регенерантов и повышение их выхода. Способ состоит в том, что регенеранты чая получают на питательной среде, за основу которой взята пропись Гамборга Вз при строгом соблюдении режимов культивирования, чередования световой и темковой фазы и фитогормонн.-;х добавок. 3 :5л

Примечание. БАП -6-бензиламинопурин; HYK -а- нафтилуксусная кислота; Кн - каллус неэмбриогенный; Кэ - каллус эмбриогенный; Р - ризогенез; ЭП - эмбриоподобные структуры.

Таблица 2

Таблица 3