СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ IN VITRO Российский патент 1995 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению регенератов in vitro.

Развитие методов биотехнологии, в основе которых лежит выращивание изолированных органов, тканей и клеток на искусственных питательных средах с последующей регенерацией целых растений, определяет все большее внедрение их в практику сельского хозяйства. Они способны значительно ускорить селекционный процесс и значительно расширить границы воздействия человека на живую природу.

При разработке методов in vitro, где требуется получение регенерантов для внедрения в процесс селекции, имеют дело с возникновением меристематических зон из каллуса и формированием из последних растений. Эта методика необходима, в первую очередь, при микроклонировании растений, а также для получения сомаклональной вариабельности и при работе на селективных средах, включающих в себя какой-либо селективный фактор (соль, гербициды, токсины фитопатогенных грибов и пр.).

В литературе имеются исследования, посвященные разработке способов формирования регенерантов зерновых, в частности пшеницы из каллусной ткани зародыша [1-2] . При использовании этих способов зародыши вычленяют из незрелых зерновок и высаживают на питательную среду для инициации каллуса. Культивирование посаженных зародышей осуществляют в темноте при t = 26^оС. Материал просматривают каждые 2-3 дн. с тем, чтобы удалить основной проросток в случае его роста и тем самым способствовать формированию каллуса на поверхности щитка. Визуально формирование каллуса отмечается на 6-10 д., однако рост основного проростка тормозит этот процесс и его приходится обламывать по крайней мере 2 раза, что очень осложняет работу.

Нарастание каллуса на щитке может происходить в течение 1-3 нед. и больше. За это время на каллусах оформляются видимые плотные очаги, отличающиеся от рыхлого оводненного каллуса по консистенции и цвету. Каллус с плотными участками оказывается морфогенным и при пересадке его или только одних плотных участков на среду для регенерации формируются сначала зеленые листообразные структуры, а спустя: 2-3 нед. проростки. Следует отметить, что с началом морфогенетического процесса плотный участок, представляющий собой кластер эмбриональных клеток, легко разделяется на отдельности (эмбриоиды), каждая из которых дает проросток, также отсаживаемый отдельно.

От посадки экспланта на питательные среды и до выхода растений - регенерантов работа проходит в три этапа: 1. - индукция каллуса и заложение меристематических зон; 2. - формирование регенерантов; 3. - подращивание растений и ускорение их перед высадкой в грунт. На каждом из этих этапов среды отличаются заменой одних добавок на другие, их количеством и соотношением. Такая замена позволяет направлять процесс или в сторону каллусообразования или органогенеза с развитием корней или регенерантов.

В процессе разработки оптимальной среды для получения регенерантов из каллуса пшеницы выбрана универсальная среда Мурасиге и Скуга, выпускаемая промышленностью в готовом виде, которая включает в себя следующие компоненты, мг/л : макросоли: NH₄NO₃ 1650; KNO₃ 1900; MgSO₄˙7H₂O 370; CaCl₂ ˙ 2H₂O 440; KH₂PO₄ 170; микросоли: MnSO₄ ˙H₂O 22,3; H₃BO₃ 6,2; ZnSO₄˙7 H₂O 8,6; CoCl₂˙6 H₂O 0,025; CuSO₄˙5 H₂O 0,025, NaMoO₄˙2 H₂O 0,25; KI 0,83; витамины: тиамин 0,1-10,0; миноинозитол 80-100; пиридоксин 0,5-1,0; никотиновая кислота 0,5-1,0.

Исходя из этапов работы по получению растений - регенерантов на указанной среде для каждого этапа предназначаются следующие добавки при культивировании зерновых, в частности пшеницы, мг/л:
Среда I (для индукции каллуса и формирования меристематических зон).

Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 20000-30000, мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л. Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 1,5-2,5 мг/л.

Среда II (для формирования регенерантов).

Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 10000-15000 мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л, α -нафтилуксусная кислота (АНУ) и кинетин по 0,5-1,0 мг/л.

Среда III (для подращивания растений и укоренения их).

Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 10000-15000 мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л. Добавок нет.

При посадке незрелых зародышей зерновых, в частности пшеницы, имеет место массовая регенерация растений. И тем не менее число растений - регенерантов сильно колеблется, в первую очередь, в зависимости от генотипа, но также и от состава культуральных сред.

Целью изобретения является разработка способа получения регенерантов растений in vitro, дающего большее количество растений, особенно на селективных средах.

Поставленная цель достигается с помощью способа получения регенерантов in vitro, включающего посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон, выращивание проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для оформления их в регенеранты, а также подращивание и ускорение растений до пересадки в грунт, отличительным признаком которого является то, что в среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000-20000 мг/л.

Использование ацетона в питательных средах для получения регенерантов высших растений в научно-технической и патентной литературе не описано, что позволяет считать, что предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Как известно, ацетон относится к группе кетоновых тел, которая включает ацетон, ацетоуксусную кислоту и β -оксимасляную кислоту. В организме ацетон распадается на СО₂ и Н₂О.

Способ получения регенерантов in vitro на средах, содержащих ацетон, был апробирован на разных культурах, в том числе пшенице, луке, чесноке, капусте и рапсе.

П р и м е р 1 (контроль). Незрелые зародыши пшеницы культивировались на питательной среде следующего состава, мг/л: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, сахароза 30000, агар-агар 7000; витамины: тиамин 10, миоинозитол 100, пиридоксин и никотиновая кислота по 1,0, 2,4-Д 2,5 (в среде для инициации каллуса или меристематических зон) или АНУ и кинетин по 1,0 (в среде для регенерации). рН 5,6-5,8.

На среду I высаживают незрелые зародыши пшеницы щитком вверх в возрасте 10-14 д. после опыления по 20 пробирок каждого образца по 6 зародышей в каждой пробирке - всего 120 зародышей каждого образца. Через 1-2 д. после посадки начинает расти заложенный основной проросток, который следует обломать. Еще через 3-7 д. необходимо просмотреть пробирки и удалить продолжающие расти остатки основного побега. Через 7-10 д. после посадки на поверхности щитка отмечают образование каллуса и его последующее нарастание. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет 76-85% от числа посаженных зародышей. Каллусы находятся на этой среде 21-28 д. - до появления плотных участков - меристематических очагов, после чего плотные участки переносятся на среду II, на которой из них в течение 4-8 нед. образуются проростки в зависимости от генотипа в 25-30% случаев. Оставшийся после переноса каллус высаживают на среду I для дальнейшего нарастания каллуса и формирования в нем новых меристем.

Возможно культивирование незрелых зародышей пшеницы на среде Мурасиге и Скуга следующего содержания, мг/л: сахароза 20000, агар-агар 60000, тиамин 1,0, миоинозитол 80, пиридоксин и никотиновая кислота по 0,5, 2,4-Д 1,5 (в среде для инициации каллуса и меристематических зон) или АНУ и кинетин по 0,6 (в среде для регенерации). рН = 5,6-5,8.

На этих средах получены результаты, аналогичные вышеприведенным, с той разницей, что при уменьшении количества 2,4-Д с 2,5 до 1,5 мг/л происходит на 2-3 д. ускорение во времени заложения меристематических зон. Эты данные дают возможность сформулировать основную (базовую) среду I и II для дальнейшей работы, мг/л: среда Мурасиге и Скуга, агар-агар 6500, сахароза 30000, тиамин 10,0, миоинозитол 100, пиридоксин и никотиновая кислота по 0,5, 2,4-Д (в среде I) 2,0 или АНУ и кинетин (в среде II) 0,5 и кинетин 1,0.

Полученные проростки переносились на среду III для подращивания и ускорения. Не отмечено разницы в подращивании и укоренении на средах, составленных по- максимуму или по- минимуму (сахароза 15000 мг/л, агар-агар 7000 мг/л или сахароза 10000 мг/л, агар-агар 6000 мг/л. Поэтому для подращивания и укоренения можно рекомендовать в качестве оптимального варианта среду Мурасиге и Скуга, содержащую сахарозу 12000 мг/л и агар-агар 6000 мг/л (базовая среда III).

Хорошо развитые растения из пробирок были высажены в грунт, где они дали семена. Следует отметить нарушение в отдельных колосьях растений регенерантов (Р_о) фертильности некоторых цветков, которое исчезало у растений первого поколения (Р₁).

П р и м е р 2 (опыт). Проводят культивирование незрелых зародышей пшеницы на среде с ацетоном следующего состава, мг/л: базовая среда I или II плюс ацетон 5000, 10000, 20000 и 50000.

Незрелые зародыши тех же образцов пшеницы культивируют вышеописанным способом (пример 1) щитком вверх в возрасте 10-14 д. после опыления по 20 пробирок каждого варианта по 6 зародышей в каждой пробирке - всего 120 зародышей каждого образца. Просмотр посадок через 2-3 д. обнаружил, что рост основного проростка угнетен: проростки не переходят к росту вообще или растут слабо и в крайнем случае требуется однократное их обламывание, что значительно облегчает работу. В этом воздействии - первое значимое преимущество сред с ацетоном.

Дальнейшее развитие каллуса идет интенсивно и через 12-15 д. в нем закладываются меристематические зоны, которые после переноса их на среду для регенерации во множестве формируют регенеранты. Число меристематических зон на среде с ацетоном составляет 87-95% по отношению к числу посаженных зародышей. На этой среде получено 53-65% регенерантов. Следует подчеркнуть высокую активность и непрерывность процесса закладки меристематических зон и связанное с этим увеличение числа регенерантов на среде с ацетоном по сравнению с контролем. Этот эффект является вторым значимым преимуществом сред с ацетоном для получения регенерантов пшениц из каллусной ткани in vitro.

Апробировано культивирование незрелых зародышей на базовой среде с ацетоном 5000, 10000, 20000 и 50000 мг/л. Лучшими вариантами по выходу каллуса, меристематических зон и регенерантов следует считать варианты с содержанием ацетона 10000 и 20000 мг/л, при этом между этими вариантами не было принципиальной разницы. При содержании ацетона в среде 5000 мг/л наблюдался слабый эффект. Культивирование зародышей на среде с содержанием ацетона 50000 мг/л привело к гибели эксплантов, поэтому этот вариант не учитывается.

Регенеранты, полученные на среде II, подращивались и укоренялись на базовой среде III и высаживались в грунт, где они давали семена. Следует подчеркнуть, что фертильность растений Р_о в грунте в варианте 10000 и 20000 мг/л ацетона была в целом практически равна таковой в контроле, но у отдельных растений в колосьях было до 50% стерильных цветков. Как и в контроле, растения Р₁ полностью восстанавливали фертильность. Кроме того, у растений Р_о и Р₁ отмечена высокая кустистость (10-30, стеблей), при этом основная часть побегов была продуктивной. В контроле кустистость была обычной для яровых пшениц - 2-5 побегов. В высокой кустистости опытных растений яровой пшеницы дающей возможность получить в Р₁ больший урожай зерна с одного куста - третье преимущество сред с ацетоном для получения регенерантов пшениц из каллусной ткани in vitro.

Пример 2 дает возможность рекомендовать среду с ацетоном для пшениц следующего составa: базовая среда плюс ацетон 15000 мг/л.

Cледует отметить, что настоящие исследования прошли экспериментальную проверку в течение 3 лет, при этом получены однозначные результаты. В связи с крайне интересными данными способ был апробирован также на культуре in vitro лука при формировании регенерантов и получены аналогичные результаты.

П р и м е р 3 (контроль). Проводят культивирование тканей донца луковиц лука с целью микроклонирования их для быстрого размножения новых сортов и ценных селекционных образцов, а также для вегетативного размножения гибридов F₁-F₂ (когда требуется сохранить их без расщепления) или стерильных межвидовых гибридов.

Поскольку донце лука содержит меристематические клетки, для микроклонирования не требуется образования каллуса и закладки в нем меристематических зон, поэтому среда I упраздняется. Посадку экспланта производят на среду II (для регенерации), представленную базовой средой, содержащей вместо кинетина 2,5-3,5 мг/л бензиламинопурина (БАП).

Для посадки луковицу освобождают от сухих чешуй, стерилизуют, отмывают стерильной водой, снимают первый ряд сочных чешуй и обрезают так, чтобы донце с остатками сочных чешуй (не более 0,5 см длиной) можно было разрезать на 5-6 участков (0,5 х 0,5 см). Каждый участок высаживается на питательную среду. Следует отметить, что экспланты, взятые с периферийных участков донца дают больше регенерантов, чем взятые из центральных участков. Культивирование проходит на свету при освещении 10-15 тыс.пкс, длине дня 16 ч и t = 20-25^оС. Через 2-3 нед появляются первые регенеранты в виде тонких зеленых иголочек, которые по мере их появления освобождают от исходных чешуй и тканей и пересаживают или на среду II для нарастания новых регенерантов, или на среду III для подращивания и укоренения. Показано, что при культивировании эксплантов на среде II, содержащей 2,5 или 3,5 мг/л БАП нет принципиальной разницы с точки зрения выхода регенерантов. Поэтому рекомендуется оптимальная среда - базовая + БАП 3,0 мг/л. Показано, что от 1 экспланта на этой среде можно получить в течение 2,5-3,5 мес. 50-70 растений, причем работу по микроклонированию можно проводить в любое время года.

П р и м е р 4 (опыт). Вышеописанным способом проводят культивирование тканей донца лука на базовой среде + БАП 3,0 мг/л + ацетон 10000-20000 мг/л. Не было принципиальной разницы в развитии регенерантов между вариантами 10000 и 20000 мг/л ацетона в среде. Поэтому следует считать оптимальной среду с ацетоном для микроклонирования лука, мг/л: базовая среда + БАП 3,0 + ацетон 20000. На этой среде количество регенерантов увеличилось в 3,5 раза, что составило, в зависимости от генотипа, за 2,5-3,5 мес. 150-300 регенерантов от одного экспланта.

Аналогичные данные получены при микроклонировании чеснока.

П р и м е р 5. Известно, что регенерация различных сортов и разновидностей капусты затруднена, что служит большим препятствием для работы in vitro и методами генной инженерии с этим объектом. Поэтому был произведен эксперимент по получению регенерантов на среде с ацетоном. Для этого семядоли проростков белокочанной капусты сортов Амагер и Июньская 10, а также капусты брокколи после стерилизации высаживали на агаризированную среду II, представленную базовой средой и содержащей вместо кинитина 2,5-3,5 мг/л БАП. Культивирование проходило на свету при освещении 10-15 тыс.лкс, длине дня 16 ч. и t = 20-25^оС. Показано, что на указанных средах ни в одном случае посадки эксплантов не было регенерантов. Поэтому произвели высадку семядолей на среду II с содержанием БАП 3,0 мг/л и дополненную ацетоном 10000-30000 мг/л. На среде с ацетоном 20000 мг/л отмечено появление максимального количества регенерантов: у сорта Амагер число эксплантов с регенерантами составило 10% (в контроле 0%), у сорта Июньская 10 - 80% (в контроле 0%), у брокколи - 11% (в контроле 0%). При посадке эксплантов на среду с ацетоном 10000 мг/л регенерантов практически не было. При посадке на среды, содержащие 30000 мг/л, регенеранты были несколько изуродованными (со скрученными листьями). Таким образом следует считать оптимальной среду с ацетоном для получения регенерантов капусты из семядолей: базовая среда + БАП 3,0 мг/л + ацетон 20000 мг/л.

При посадке гипокотиля проростков капусты на оптимальную среду с ацетоном у брокколи получено 44% эксплантов с регенерантами, в контроле - 13%.

Аналогичные результаты получены и при посадке in vitro тканей рапса.

Таким образом на основании приведенного материала можно сделать вывод, что введение ацетона в питательную среду имеет преимущество в технике получения регенерантов in vitro.

Использование: биотехнология растений, культивирование тканей и клеток, микроклонирование. Сущность изобретения: растения - регенеранты получают in vitro, при этом для увеличения регенерации в питательные среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000 - 20000 мг/л.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ IN VITRO, включающий посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон, получение проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для формирования регенерантов, подращивание и укоренение растений на питательной среде до высадки их в грунт, отличающийся тем, что в питательные среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000-20000 мг/л.