Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к методам мик- роклонального размножения растений ин витро и может быть использовано для ускоренного получения посадочного материала северных видов хвойных пород.

Существует два основных подхода к микроклонированию ин витро: органогенез, при котором образуются побеги, и соматический эмбриогенез, когда происходит образование эмбрионов не из зиготы, как при половом размножении, а из соматических клеток.

Известен способ получения проростков из соматических эмбрионов ели, включающий получение эмбриогенного каллуса из зрелых семенных зародышей на половинной агаризованной среде Брауна и Лоренса с добавлением нафтилуксусной (НУК)или 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 6-бензиламинопурина (БАП), созревание соматических эмбрионов на агаризованной среде Арнольд и Эриксона с добавлением 0,3 мг/л абсцизовой кислоты (АБК) и индукцию корней на той же среде без гормонов. (Verhagen S.A., Wann S.R. о ел XI

Norway spruce somatic embryogenesis: high frequency initiation from light-cultured mature embryos. - Plant Cell. Tissue a. Organ Culture. 1989, 16, c. 101-111).

Известен способ, при котором культивирование зрелых зародышей происходит в темноте с использованием на первом этапе среды Арнольд и Эриксона с добавлением 2,2 мг/л 2,4-Д, 1,1 мг/л БАП и 1% сахарозы, а на втором этапе с добавлением 0,2 мг/л НУК и 0,3 мг/л АБК, (Tain S.M. Newton R.I., Soltes E.I. - Enhancement of somatic embryogenesis in Norway spruce (Picea abies L.) - Theoretical a, applied genetics. 1988, 76, 4, c. 501-506).

Известен способ поэтапного культивирования незрелых зародышей на ага- ризованной среде Арнольд и Эриксона с 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л БАП (для инициации эмбриогенного каллуса), с 1 % активированного угля в течение 1 недели, с добавлением 0,3 мг/л АБК и 0,2 мг/л ин- долилмасляной кислоты (ИМК) в течение 2 недель и с дальнейшими пересадками на свежую среду с АБК и ИМК через каждые 3 недели (для стимуляции созревания), с разбавлением среды 1:3 и исключением гормонов (для проращивания соматических эмбрионов). (Becwar M.R., Noland T.L., Wyckoff I.L - Maturation, germination and conversion of Norway spruce (Picea abies L.) somatic embryos to plants.- In vitro, 1989,25, 6, c. 575-580).

В СССР вообще нет публикаций, касающихся соматического эмбриогенеза хвойных пород ин витро.

Общим недостатком описанных СПОСОБ является невысокая продуктивность отдельных этапов формирования соматических эмбрионов и низкий выход регене- рантов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ регенерации растений из зрелых и незрелых семян путем темновой индукции эмбриогенного каллуса на среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:1, с 1,9 мг/л НУК, 1,1 мг/л БАП и 1% сахарозой, темновой стимуляции созревания соматических эмбрионов на той же среде с 2,0 мг/л АБК и 3% сахарозы и укоренения на свету при 20-часовом фотопериоде на безгормонной среде Арнольд и Эриксона с 2 % сахарозой (Arnold S., Hakman I. - Regulation of somatis embryo development in Picea abies by abscisis acid (ABA) - J. Plant Physiol., 1988, 132,3, 164-169).

Однако выход растений-реагентов по данному способу также невелик.

Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов.

Поставленная цель достигается тем, что в отличие от известного способа, включающего инициирование эмбриогенного каллуса на агаровой питательной среде

Арнольд и Эриксона, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде с использованием абсцизовой кислоты и последующее их проращивание, на этапе получения соматических эмбрионов

0 на питательную среду Арнольд и Эриксона абсцизовую кислоту вводят совместно с 6-бензиламинопурином, а проращивание осуществляют на свету на жидкой среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3 с

5 2% сахарозой. В качестве поддержки при проращивании используют гранулы полиэтилена высокой плотности.

Абсцизовую кислоту и 6-бензиламино- пурин вводят в питательную среду в количе0 стве 2 мг/л и 0,2 мг/л соответственно.

Таким образом, сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом подтверждает его соответствие критерию изобретения новизна.

5 Для выявления соответствия заявляемого технического решения критерию существенные отличия проведен поиск известных решений, содержащих отличительные от прототипа признаки, в результа0 те которого выявлено раздельное поэтапное введение БАП и АБК в питательную среду, в частности, во всех указанных выше аналогах, где они выполняют свою роль регулятора роста.

5

Действие АБК известно как ингибитора клеточных делений, ростовых и регенераци- онных процессов, как индуктора старения, ингибитора синтеза РНК, ферментов белко0 вого синтеза и фотосинтеза. (В.И. Кефели, В.М. Коф, П.В. Власов, Е.Н. Кислин. Природный ингибитор роста -абсцизовая кислота. М. Наука, 1989, с. 183).

Отмечена роль БАП в активизации кле5 точных делений, ростовых и регенерацион- ных процессах, в задержке старения, его способность активизировать синтез РНК и белка, ферментов белкового синтеза и фотосинтеза, активизировать транспорт

0 метаболитов (О.Н. Кулаева. Цитокинины, их структура и функция. М., Наука, 1973, с. 264. Е.Г. Романенко, С.Ю. Селиванкина и др. Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК ин

5 витро. Докл. АН СССР 1980, 252, 2, 488- 489).

Известно стимулирующее действие АБК и БАП (вместе) на синтез РНК, причем АБК увеличивает количество РНК с низкой молекулярной массой, а БАП - с высокой

(С.Ю. Селиванкина, Романенко Е.Г., Кара- вайко М.Н., Кулаева О.Н. Активизация синтеза РНК ин витро под действием цитокинина и абсцизовой кислоты в присутствии цитокининосвязывающих белков. Докл. АН СССР, 1983, т. 272, 3, 761-763).

Однако совместное применение АБК и БАП в данном случае использовалось лишь для изучения механизма их действия и не затрагивало проблемы морфогенеза.

Эффект применения АБК на стадии формирования зрелых соматических эмбрионов связан с торможением деления эмбриогенных клеток, в результате чего, по-видимому, создаются благоприятные эндогенные условия для дальнейшего развития образовавшихся ранее проэмб- риональных структур.

Усиление действия АБК в присутствии БАП скорее всего объясняется способностью последнего активизировать транспорт подвижных метаболитов к центрам эмбриональной активности. Таким образом, при совместном введении в питательную среду БАП и АБК проявляется новое их свойство как стимулятора созревания соматических эмбрионов, что ведет в свою очередь к увеличению выхода растений-регенерантов.

Таким признаки, как проращивание соматических эмбрионов на свету на жидкой среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3 с 2% сахарозой, с использованием в качестве подддержки гранул полиэтилена высокой плотности не выявлены в других технических решениях при изучении информационных источников в данной области биологии. Следовательно, заявляемый объект соответствует критерию изобретения существенные отличия.

Предлагаемый способ реализован следующим образом. Опыты были проведены в лаборатории лесовосстановления ЛенНИ- ИЛХ.

При инициировании эмбриогенного каллуса зрелые и незрелые семенные зародыши ели помещают на агаризован- ную модифицированную среду Арнольд и Эриксона (1981) с 450 мг/л NH4N03, 50 мг/л L-глутамина, 3% сахарозы, 2,2 мг/л 2,4-Д(дихлорфеноксиуксусной кислоты) и 1,1 мг/л бензиламинопурина.

Полученный на этой среде эмбриоген- ный каллус через 6 недель переносят на поддерживающую рост среду Арнольд и Эриксона, разбавленную 1:1, с 1200 мг/л NH/iNOs, 50 мг/л L-глутамина, 3% сахарозы, 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л БАП, продолжительность культивирования на которой еще 6 недель. Первые 9 недель культуры растут

в темноте, затем при 16-часовом фотопериоде до формирования соматических эмбрионов.

Для стимуляции созревания соматических эмбрионов каллус переносят на среду того же состава с пониженным до 2% содержанием сахарозы, 0,2 мг/л БАП и 2 мг/л АБК. Затем через каждые 3 недели каллусы пассируют на эту же основную среду с 2,0 мг/л АБК без БАП и многократно отделяют созревшие соматические эмбрионы.

На этапе проращивания отделяемые соматические эмбрионы высаживают на стерильные гранулы полиэтилена высокой плотности, покрытые слоем марли, увлажненной жидкой безгормональной средой Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, с 2% сахарозой.

После 4 недель проращивания проростки с первичным корнем длиной не менее 10 мм высаживают в стерильную смесь торф- песок-перлит (6:2:1 по объему). Растения содержат под полиэтиленовой пленкой при 16-часовом фотопериоде (освещенность 3,0 тыс. лк), ежедневно опрыскивают водой и через день поливают раствором минеральных солей по Арнольд и Эриксону, разбавленным 1:3.

В тех же условиях были проведены опыты, в которых на этапе проращивания соматических эмбрионов использована агаровая среда по прототипу и жидкая среда Арнольд

и Эриксона, разбавленная 1:3. с различным содержанием сахарозы.

Опытные данные сведены в таблицу. Наилучшие результаты отмечены при использовании жидкой среды Арнольд и

Эриксона, разбавленной 1:3, с 2% сахарозой.

При использовании 1% сахарозы получают лишь 55% корнеобразования.

Увеличение же содержания сахарозы

выше 2% не влияет на процент корнеобразования, не уменьшает длину корня, что важно при перенесении проростков в почву.

Из приведенных результатов исследований видно, что при использовании жидкой среды Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, образование корней увеличивается до 82% по сравнению с 32% на агаровой среде по прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ за счет стимуляции созревания соматических эмбрионов и стимуляции корнеобразования, достигаемой совокупностью отличительных признаков, дает еледующие преимущества на примере незрелых семян(табл.2).

При использовании в опытах зрелых семян изменяется лишь показатель частоты образований эмбриогенных линий, составляющий 65%.

Предлагаемый способ позволяет получить в среднем 200 проростков от одного зрелого семени и 300 от незрелого на срок 6-7 месяцев.

Формула изобретения

1. Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро, включающий эксплантацию зиготического зародыша и инициацию эмбриогенного каллуса на агаризованной питательной среде Арнольд и Эриксона, содержащей ауксины и цитокинины, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде, содержащей 2,0 мг/л абсцизовой кислоты, и

последующее выращивание из эмбриоидов растений-регенераторов на безгормональной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода растений-регенерантов, на этапе получения соматических эмбриоидов в питательную среду абсцизо- вую кислоту вводят совместно с 6-бензила- минопурином и растения-регенеранты получают на жидкой питательной среде с

использованием для поддержки эмбриоидов гранул полиэтилена высокой плотности, при этом содержание сахарозы в среде составляет 2%, а остальные ингредиенты питательной среды разбавляют в соотношении 1:3.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода соматических эмбриоидов, для начала стимуля- ции их образования б-бензиламинопурин вводят в питательную среду в количестве 0,2 мг/л.

Таблица 1

Использование: биотехнология, культивирование тканей и клеток, лесное хозяйство. Сущность изобретения: зиготический зародыш эксплантируют на питательную среду Арнольд-Эриксона, получают первичный каллус, который переносят на ту же среду, дополнительно содержащую 6- БАП и АБК, получают соматические эмбрио- иды, Полученные эмбриоиды помещают на жидкую питательную среду, содержащую 2% сахарозы и 1/4 часть ингредиентов по прописи Арнольд-Эриксона и получают ре- генеранты с использованием для поддержки гранул полиэтилена высокой плотности. 1 з. п. ф-лы, 2 табл. СО с «

Таблица 2