Способ выращивания сеянцев рода Cerasus Mill. Российский патент 2025 года по МПК A01G31/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству: к питомниководству, в частности к селекции с использованием биотехнологических методов, и заключается в ускоренном получении большего количества хорошо развитых сеянцев и их клонов - представителей рода Cerasus Mill. (Pr. cerasus L.) -вишня обыкновенная, черешня, виды вишни и их гибриды.

В практике селекции применяются следующие способы получения гибридных сеянцев плодовых культур.

Это выращивание:

- в открытом грунте, посевом в селекционном питомнике;

- в лабораторных условиях из скарифицированных косточек;

- с использованием культуры зародышей in vitro.

Последний способ получил достаточно большое распространение среди селекционеров-биотехнологов при выращивании гибридов на основе применения искусственных агаризированных питательных сред. Он облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс при создании новых форм и сортов растений плодовых культур.

А.И. Здруйковская-Рихтер из зародышей недоразвитых плодов алычи (от повторного цветения в октябре) в культуре in vitro получила сеянцы с ускоренным развитием, которые на третий год зацвели и дали плоды (Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений in vitro. - М., 1974. - 60 с.).

Известно, что при отдаленной гибридизации косточковых плодовых культур имеет место постгамная несовместимость. Она выражается в образовании недоразвитых, «щуплых» семян. В работе Кухарчик Н.В., Кастрицкой М.С., Пугачевой P.M. «Методика культивирования изолированных зародышей вишни и сливы» (Плодоводство, 2006:18(2): 157-162) показана возможность ее преодоления за счет выращивания изолированных зародышей на агаризированных питательных средах. К сожалению, коэффициент выхода при этом незначителен.

Авторами статьи «Культивирование зародышей in vitro гибридов раносозревающих сортов черешни (Prunus avium L.) Коваленко Н.Н. и Гладких СВ. показана эффективность выращивания гибридных сеянцев черешни раннего срока созревания, которые в обычных условиях практически не дают сеянцев, с применением культуры зародышей были получены сеянцы, но с применением агаризированных питательных сред на которых выращивались вызревшие зародыши из спелых плодов (Вавиловский журнал генетики и селекции, 2019, 23(6): 765-771).

Жидкие питательные среды используются в основном при выращивании микрорастений на этапах пролиферации и укоренения. Известен такой способ для укоренения микрочеренков винограда, предложенный П.Я. Голодрыга, В.А. Зленко и др. описанный ими в «Методических рекомендациях по клональному микроразмножению винограда (Магарач, 1986)». С этой целью используют фильтровальные мостики, устанавливаемые внутри пробирок с жидкой питательной средой Мурасиге и Скуга (1962) - МС, на которые высаживают микрочеренки винограда.

Известен способ (патент РФ 2039428 М.Т. Упадышев, 1995), где предложена жидкая питательная среда МС с заменой сахарозы на гомополисахарид в количестве 25 000-100 000 мг/л для культивирования in vitro на этапе микроразмножения и внесение нового компонента увеличило приживаемость эксплантов на 79,5-94,5% от числа почек и в 2,8-3,2 раза побегов, увеличило длину побегов в 3,2-6,9 раз, ускорив процесс производства посадочного материала.

Жидкие питательные среды в сравнении с агаризированными имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов, что сказывается на более быстром росте недоразвитых зародышей. Однако, при полном погружении в такую среду плодов, очень часто имеет место гибель зародыша вследствие создания неблагоприятных для его развития анаэробных условий. Для предотвращения их гибели, возможно, применять «мостики» из фильтровальной бумаги, но этот прием значительно снижает технологичность процесса и ведет к увеличению трудозатрат при селекционном процессе (Яковлев, Кожин, Луткова, Дубовицкая, 1979).

С целью повышения эффективности отдаленной гибридизации и получения сеянцев из недоразвитых завязей имеет место в разработках биотехнологов: Джей Пи Нич на томатах (1949, 1951, 1952), Capitede на землянике (Fragaria virginica) и горохе посевном (Pisum sativum) (1955), Guh на плодах чеснока (Allium сера) (1962).

Наиболее близок к предлагаемому способу является способ, описанный в публикации Джигадло Е.Н. и др. «Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами» (Орел, 2005) и примененный на груше: завязь в культуру in vitro вводилась на 30-35 дневном их развитии после поверхностной стерилизации 0,1% сулемой в течение 15 минут с трехкратной промывкой стерильной водой вместе с плодоножкой, помещаясь на питательную среду на основе состава среды Нича.

Модификация среды была обогащена сахарозой в удвоенной концентрации, в нее добавлен кинетин (0,1 мг/л), ИУК (0,1 мг/л), дрожжевой экстракт (200 мг/л) и гидролизат казеина (400 мг/л). Через 6-7 недель после культивирования при постоянной положительной температуре воздуха 25-30°С и освещенности 2-2,5 тыс. люкс, из них вычленяли зародыши и высаживали на питательную среду Смирнова. Затем, через 10 дней, происходило позеленение семядолей и их раскрытие. Таким способом были получены растения гибрида груши Северянка × Нежность (Яковлев, Кожин, Луткова, Дубовицкая, 1979).

Недостатком такого способа является очень усложненная питательная жидкая среда и обработка завязей сулемой, в настоящее время запрещенной к использованию в биотехнологии, а также очень длительный период времени от процесса оплодотворения до начала развития сеянцев, в среднем, более трех месяцев. К тому же, данная работа проведена на семечковой плодовой культуре - груше при внутривидовом скрещивании. Работ в этом направлении по плодовым косточковым культурам не обнаружено.

Техническим результатом заявляемого способа является увеличение выхода жизнеспособных сеянцев из культуры зародышей in vitro гибридов рода Cerasus Mill., как от внутри-, так и межвидовых скрещиваний и сокращение сроков развития до одного месяца, а также улучшение производительности труда, снижение затрат на селекционный процесс при отдаленной гибридизации с возможностью получения необходимого количества клонов и ускорение его на два-три года в целом.

Технический результат достигается в способе выращивания сеянцев зародышей рода Cerasus Mill., предусматривающем забор в саду растительного материала, стерилизацию материала: плод с плодоножкой, зародыш, семя, доращивание завязи в культуре in vitro с трехкратной промывкой стерильной водой вместе с плодоножкой, помещая ее в питательную среду на основе состава среды Нича, культивирование in vitro и проведение этапа ex vitro, согласно изобретению, в качестве растительного материала используют плоды с плодоножкой сортов рода Cerasus Mill., при этом культивирование in vitro зародышей сортообразцов рода Cerasus Mill., проводят в 2 этапа: на I этапе - до созревания плода осуществляют культивирование in vitro зародышей в плодах с плодоножкой, которую помещают в искусственную жидкую питательную среду без соприкосновения плода с питательной средой и не применяя «мостики» и выдерживают в условиях светозала в течение 21-23 дней, а на II этапе - из вызревшего плода извлекают косточку, скарифицируют ее и проводят культивирование in vitro зародыша на агаризированной питательной среде.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что за счет двухэтапного культивирования in vitro зародышей плодовых косточковых культур представителей рода Cerasus Mill., обеспечивается увеличение выхода жизнеспособных сеянцев из культуры зародышей in vitro гибридов рода Cerasus Mill., как от внутри-, так и межвидовых скрещиваний и сокращение сроков развития до одного месяца, снижение затрат на селекционный процесс при отдаленной гибридизации с возможностью получения необходимого количества клонов и ускорение его в целом на два-три года кроме того, улучшается производительность труда.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлено фото, на котором изображено культивирование in vitro зародышей вишни в плодах с плодоножкой на искусственной жидкой питательной среде (с 19-го дня после оплодотворения); на фигуре 2 представлено фото, на котором изображено культивирование in vitro зародышей черешни в плодах с плодоножкой на искусственной жидкой питательной среде (с 19-го дня после оплодотворения); на фигуре 3 представлено фото, на котором изображено культивирование in vitro зародышей вишни (через 21 день после высадки в условиях светозала) в плодах с плодоножкой на искусственной жидкой питательной среде; на фигуре 4 представлено фото, на котором изображено культивирование in vitro зародышей черешни (через 21 день после высадки в условиях светозала) в плодах с плодоножкой на искусственной жидкой питательной среде; на фигуре 5 представлено фото сформированного зародыша семени вишни обыкновенной сорта Тугеневка; на фигуре 6 представлено фото - пересадка зародыша семени вишни с жидкой на агаризированную питательную среду; на фигуре 7 - фото, на которых изображен процесс развития сеянцев из зародышей на агаризированной питательной среде: а - расположение подготовленных плодов в культуральных сосудах - стеклянные пробирки с жидкой искусственной питательной средой; б - с обновленными срезом нижней части плодоножки, при этом сам плод не касается среды и находится над ее верхним уровнем, в - изображен сеянец из зародыша на агаризированной питательной среде.

Осуществление способа выращивания сеянцев рода Cerasus Mill. Предварительно осуществляют забор в саду растительного материала, в качестве которого используют плоды с плодоножкой сортов рода Cerasus Mill. Затем проводят стерилизацию материала плод с плодоножкой, проводят доращивание завязи в культуре in vitro с трехкратной промывкой стерильной водой вместе с плодоножкой, помещая ее в питательную среду на основе состава среды Нича, культивирование in vitro и проведение этапа ех vitro. Культивирование in vitro зародышей сортообразцов рода Cerasus Mill., проводят в 2 этапа:

I этап (фигуры 1-4) - доразвитие зародышей недозрелых (с девятнадцатидневного срока после оплодотворения и далее) плодов (с плодоножкой) в условиях светозала в течение 12-25 дней (в среднем 17) с использованием искусственных жидких питательных сред для дополнительного питания зародышей и роста семядолей, без непосредственного погружения зародыша в питательную среду и применения «мостиков» из фильтровальной бумаги или другого материала. Для поверхностной стерилизации плодов используется хлорсодержащий препарат (бытовой) и 3% перекись водорода.

II этап (фигуры 5,6) - последующая посадка зародыша после скарификации в стерильных условиях бокса на агаризированную питательную среду.

Забор объекта - плодов с плодоножками видообразцов и сортов рода Cerasus Mill., (вишня кислая, черешня, дальневосточные виды вишен и т.п.) проводится в фазу II-III опадения плодов в саду при естественном опылении на 19-е и последующие сутки после искусственного (принудительного опыления). Такие недозрелые с недоразвитым зародышем плоды, вместе с плодоножками, сортов вишни, черешни и их гибридов с дальневосточными видами вишни проходят поверхностную стерилизацию по разработанной технологии в два этапа: а) водным раствором хлорсодержащего препарата Део-Хлор (одна таблетка 3,75 г на 210 мл воды) с последующей промывкой в стерильной дистиллированной воде (четыре раза по пять минут);

б) затем следует их обработка 3% перекисью водорода (завершающая статия стерилизации). Поскольку этот стерилизующий агент является неустойчивым соединением и на свету распадается в течение трех дней, то смывать его не требуется. Он не оказывает отрицательного влияния на регенерационные способности зародышей, но эффективно обеззараживает от патогенной микрофлоры в течение некоторого времени в культуральном сосуде.

I этап культивирования in vitro зародышей представителей рода Cerasus:

в стерильных условиях ламинар боксов подготовленные плоды по одному помещаются пинцетом в культуральные сосуды - стеклянные пробирки с жидкой искусственной питательной средой с обновленными срезом скальпелем нижней части плодоножки, при этом сам плод не касается среды и находится над ее верхним уровнем.

Не соприкасаясь с жидкостью в пробирке, зародыши внутри плода не испытывают недостатка воздуха, а через плодоножку по ее сосудам получают необходимые питательные вещества из среды. Избегая, таким образом применения различных «мостиков» уменьшаются трудозатраты и улучшается (ускоряется) технологичность процесса культивирования in vitro.

В качестве жидких питательных сред были использованы две: Нича, Азахиры и др., а также - Чатурведи и Чоудхари по прописи (без изменений), при рН=5,8.

Культивирование незрелых плодов проводится в стеклянных пробирках (30 × 210 мм) в штативах, размещенных на полках, снабженных люминесцентными лампами ЛД-40. Интенсивность освещения при этом 3,0 тыс. люкс, фотопериод 16/8 часов при температуре воздуха +24°С в светозале.

II этап культивирования in vitro зародышей. По мере развития зародышей через 20-23 дня (22 сутки в среднем) окраска плодов меняется до характерной для данного сорта материнской формы (желтой, красной, бордовой и т.п.) и они увеличиваются в диаметре (практически до стенок пробирки). Такие плоды вынимаются из пробирок, вычленяются косточки, промываются мыльным раствором и скарифицируются в стерильных условиях ламинар бокса и семена (зародыши) высаживаются на подготовленную агаризированную питательную среду - модификацию среды Мурасиге и Скуга (1962) в зависимости от культуры. I этап - на жидкой питательной среде позволил минимизировать стресс, переживаемый зародышем от ввода в культуру, и способствовал прохождению их полной дифференцировке. На агаризированной питательной среде на II этапе полностью сформированный зародыш, не вошедший в период покоя, после позеленения и раздвижения семядолей дает рост корешку и ростку в пробирочной культуре. Такие последовательные изменения с зародышами начинают происходить уже через 10-14 дней после ввода.

Способ двухэтапного культивирования зародышей in vitro, позволил увеличить выход высококачественного растительного материала гибридов косточковых плодовых культур - черешни и вишни за относительно короткий период: от одного-двух месяцев (июнь) до трех-четырех (август), избежав периода покоя семян. Процент развившихся сеянцев, в среднем, через 32 дня высокий для гибридов - от 45 до 98,8%.

Через 20-23 дня (в среднем 22), что соответствует 42-му дню развития от оплодотворения (17.05 - 19-й день, а 10.06 - 42 день) пересаживаются после скарификации косточек, зародыши на агаризированную питательную среду.

В дальнейшем гибридные сеянцы-проростки пригодны для посадки ех vitro или же для клонирования, т.е. перехода на микроразмножения in vitro. Последнее важно для недоразвитых проростков - без корней.

Для подтверждения эффективности способа были проведены производственные опыты в лаборатории биотехнологии и биохимии Крымской ОСС филиала ВИР (2018-2021 гг.). Для опытов были использованы сорта рода Cerasus Mill., (сорта вишни: Чудо Вишня, Любская и сорта черешни: Валерий Чкалов, Ярославна).

Результаты этих опытов представлены в примерах конкретного применения.

Пример 1. Контроль. Агаризированная питательная среда Мурасиге и Скуга, модификация MSu, - дата посадки на 19-й день. Черешня сорта Ярославна, количество использованных плодов (зародышей) 100 шт., выход сеянцев - 20 шт., черешня сорт Ярославна 20%, черешня сорт Валерий Чкалов - 29,3%, вишня сорт Чудо Вишня - 40,7%, вишня сорт Любская -10%.

Пример 2. Черешня Валерий Чкалов

Сбор плодов и посадка - 19-й день после опыления.

I этап культивирования in vitro зародышей

- на жидкой питательной среде Нича, Азахиры и др. высажено 100 шт., 98,1% развившихся плодов из них на II этапе культивирования in vitro -79,7% выход сеянцев;

- на жидкой питательной среде Чатурведи и Чоудхари - 97,5% из них -47,7% выход сеянцев на II этапе культивирования

Пример 3. Черешня Ярославна

Сбор плодов и посадка - 19-й день после опыления.

I этап культивирования зародышей, развившихся плодов - 99,0% (из 100 шт.), из них на II этапе культивирования in vitro получено 58,0% сеянцев.

Пример 4. Вишня, сорт Чудо Вишня

I этап сбор плодов и посадка на 19-й день после опыления на жидкую питательную среду Нича, Азахиры и др. 100 шт. из них развилось 80,0% плодов; после посадки на агаризированную питательную среду семян (II этап) из плодов получено - 70,0% сеянцев.

Пример 5. Вишня, сорт Любская

I этап культивирования, 100 штук плодов, собранных на 19-й день после опыления, высаживали на жидкую питательную среду Нича, Азахиры и др., и через 20 дней получали 100 шт. развитых плодов (100%);

II этап культивирования на среде агаризированной, выход - 89%. Сопоставляемый анализ предлагаемого решения получения сеянцев (или их клонов) из слабо дифференцированных зародышей показывает, что изолированные зародыши такого же возраста, непрошедшие первый этап in vitro, были практически все нежизнеспособны.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выращивания сеянцев зародышей плодовых культур, предусматривающий забор в саду растительного материала, стерилизацию материала: плод с плодоножкой, зародыш, семя, доращивание завязи в культуре in vitro с трехкратной промывкой стерильной водой вместе с плодоножкой, помещая ее в питательную среду, культивирование in vitro и проведение этапа ex vitro, при этом в качестве растительного материала используют плоды сортов рода Cerasus Mill., а культивирование in vitro зародышей сортообразцов рода Cerasus Mill. проводят в 2 этапа: на I этапе для доразвития осуществляют культивирование зародышей с 19-го дня после оплодотворения in vitro в плодах с плодоножкой, которую помещают в питательную среду Нича, Азахиры, Чатурведи или Чоудхари без соприкосновения плода с питательной средой и выдерживают в условиях светозала в течение 21-23 дней, а на II этапе из вызревшего плода извлекают косточку, скарифицируют ее и проводят культивирование in vitro зародыша на агаризированной питательной среде Мурасиге и Скуга. Изобретение позволяет увеличить выход жизнеспособных сеянцев из культуры зародышей in vitro гибридов рода Cerasus Mill., как от внутри-, так и межвидовых скрещиваний, и сокращение сроков развития до одного месяца. 7 ил., 2 пр.

Способ выращивания сеянцев зародышей плодовых культур, предусматривающий забор в саду растительного материала, стерилизацию материала: плод с плодоножкой, зародыш, семя, доращивание завязи в культуре in vitro с трехкратной промывкой стерильной водой вместе с плодоножкой, помещая ее в питательную среду, культивирование in vitro и проведение этапа ex vitro, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют плоды сортов рода Cerasus Mill., а культивирование in vitro зародышей сортообразцов рода Cerasus Mill. проводят в 2 этапа: на I этапе для доразвития осуществляют культивирование зародышей с 19-го дня после оплодотворения in vitro в плодах с плодоножкой, которую помещают в питательную среду Нича, Азахиры, Чатурведи или Чоудхари без соприкосновения плода с питательной средой и выдерживают в условиях светозала в течение 21-23 дней, а на II этапе из вызревшего плода извлекают косточку, скарифицируют ее и проводят культивирование in vitro зародыша на агаризированной питательной среде Мурасиге и Скуга.