БИОЛАРВИЦИД И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к препаратам против кровососущих насекомых и способам их получения.

Известны препараты для борьбы с кровососущими насекомыми (комарами) на основе грибов, простейших, бактерий и т.д. [1].

Наибольшее распространение получили препараты на основе Bac. thuringiensis - вектобак, текнар, бактимос, бактокулицид, бактоларвицид и другие [2] , содержащие смесь токсинов, спор и остатков культуральной жидкости - спорокультуральный комплекс (СКК).

Препараты получают культивированием бактерий, концентрированием культуральной жидкости (КЖ) и введением различных добавок.

Основным недостатком препаратов является кратковременность действия.

Более высокую длительность действия имеют биоларвициды на основе Bac. sphaericus [3]. Наиболее эффективными при этом являются ларвициды, состоящие из инертного носителя - алюмосиликатов, кварца, каолина, карбонатов и т.п. материалов и СКК, содержащего 10⁹ - 10¹¹ спор на грамм [4]. Указанный ларвицид является прототипом предлагаемой композиции. Препарат получают распылением СКК на гранулы носителя. Недостатком биоларвицида является малая длительность его действия - до 12 ч.

Известны биоларвициды, сохраняющие эффективность в течение более длительного срока действия за счет использования плавающего носителя и нанесения полимерной пленки. Так, получили биоларвицид, содержащий активное начало, нанесенное на фрагменты кукурузных початков с последующим покрытием гранул желатином. При содержании 32% активного начала и 7% желатина активность препарата сохраняется 44 дня. При использовании в качестве носителя бентонита препарат инактивируется через 24 ч [5]. Недостатком препарата является недостаточно высокая длительность действия.

Прототипом предлагаемого способа является аналогичная технология, заключающаяся в нанесении на носитель пестицидного материала и покрытии гранулы пленкой полимера [6]. В качестве носителя используют воск, в качестве пленки - гидролизаты животных белков.

Недостатком прототипа является невысокая длительность эксплуатации (до 2 мес.).

Задачей изобретения являлось создание биоларвицида длительного срока действия.

Биоларвицид на основе Bac. sphaericus со сроком действия не менее 6-12 мес. был получен при использовании в качестве носителя пористых железосодержащих материалов и нанесении на него пленки из полимерного материала, имеющего полярные группы.

В качестве носителя, в частности, могут быть использованы перлиты, шлаки доменных печей, гари и иные материалы, обладающие пористостью и способностью электризоваться под действием внешних факторов.

Оптимальные результаты были получены при использовании перлитов, в частности "вспученных перлитов", т. е. перлитов, подвергнутых обработке при 1000-1200^oC и представляющих собой частицы размером 1-6 мм с насыпной плотностью 0,1-0,6 г/см³. Частицы обладают хорошей плавучестью. К исходу 8-го мес. тонет около 50% [7].

В качестве пленкообразующих материалов используются полимеры, имеющие полярные группы, в частности производные целлюлозы - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), метилцеллюлоза, поливиниловый спирт и т.п.

В качестве активного начала использовались спорокультуральные комплексы Bac. sphaericus, в частности штаммы B101 и B101/17 (коллекция ЦМПМ НИИГенетика и "Биотех-ВЦ").

Штамм B101 является природным, выделенным из погибших личинок комаров, штамм B101/17 получен на базе "Биотех-ВЦ" в ходе селекции указанного штамма по признаку инсектицидной активности.

Оба штамма имеют сходные морфологические и физиологические характеристики: молодые клетки имеют вид палочек, очень подвижны, размер их зависит от возраста культуры. При формировании субтерминально расположенной споры клетки приобретают булавовидную форму, споры округлые. На МПА колонии суточной культуры желтовато-белые, гладкие, блестящие, округлые с ровным краем, пастообразные. На картофельном агаре рост по штриху обильный, сплошной, с волокнистым краем, серовато-белого цвета, пастообразный, зернистой консистенции, пигмента не образует. Мясо-пептонную желатину разжижают не очень интенсивно. При посеве уколом на МПА - рост на поверхности и в верхнем слое. На мясо-пептонном бульоне через двое суток наблюдается образование рыхлого осадка (довольно обильного); бульон слегка мутноватый, помутнение однородное.

Клетки штамма B 101/17 характеризуются большей подвижностью.

Биохимические свойства штаммов: не утилизируют углеводы -глюкозу, сахарозу, ксилозу, арабинозу, маннозу, маннит, глицерин. Обладают активностью протеазы, уреазы, каталазы. Крахмал не гидролизуют, нитраты не восстанавливают.

Они хорошо растут на дрожже-соевой среде (2% сои, 2% БВК) и на более бедных средах (2 и 3% БВК). Продуктивность штаммов B101 и B101/17 на дрожже-соевой среде составляла (3,0±1,1) • 10⁹ и (4,0±0,5)•10⁹ спор/см³ соответственно. Инсектицидная активность штамма B101 - ЛК₅₀ в отношении комаров Aedes aegypti составляет - (10,7±5,9) • 10⁴ спор/мл; ЛК₅₀ штамма B 101/17 - (5,1±2,2) • 10⁴ спор/мл (ЛК₅₀ эталонного штамма Bac. sphaericus 2362 - 19•10⁴ спор/мл.

Вирулентность по отношению к Culex pipiens составляет для одного из наиболее известных вирулентных штаммов B. sphaericus 1593 [8] - 3,3 • 10³, для B101 (0,52±0,034) • 10³ спор/см³, для B101/17 - (0,15±0,034) • 10³ спор/см³. Против Anopheles stephensi активность B101/17 - (1,9 ±0,15) • 10³, B101 - (10,6±0,56)•10³.

Наряду с данными штаммами могут быть использованы и другие известные штаммы бактерий Bacillus sphaericus, обладающие ларвицидной активностью в отношении личинок кровососущих комаров. Готовый ларвицид содержит 20-85 мас. % спорокультурального комплекса,5-40 мас.% полимерного материала, остальное - носитель.

Снижение концентрации СКК ниже 20% дает препарат низкой эффективности, повышение содержания СКК более 85% не позволяет получать стабильный плавучий препарат (полная инактивация при 90% за 3 мес.). Понижение доли полимера менее 5% не позволяет получить стабильную структуру (при 3% содержании ПВС полная потеря активности за 30-40 дней). Концентрация полимера более 40% снижает выход активного начала в среду и соответственно его эффективность.

Препарат готовят путем введения в КЖ, содержащую активное начало, полимерного материала с последующим смешением с носителем, высушиваением в условиях его электризации.

Сочетание этих процессов оптимально достигается в установках кипящего слоя, где на гранулы носителя оседает смесь СКК и полимера. При этом частицы железосодержащего носителя в результате интенсивного трения получают статический заряд (возможно получение дополнительного заряда от внешнего источника), поле которого, взаимодействуя с полярными группами полимера, создает определенную структуру, имеющую стабильный заряд.

Оптимальными параметрами является выдержка материала в этих условиях в течение 30-90 мин при 70-85^oC.

При уменьшении времени и/или температуры процесса не достигается достаточное удаление воды (до 7%), что снижает срок хранения препарата. Повышение температуры ведет к снижению активности бионачала, повышение времени обработки снижает производительность процесса.

При контакте с водой полимерная пленка на поверхности гранулы начинает набухать и постепенно растворяться. Наличие заряженной структуры и гранул позволяет стабилизировать полимерную оболочку в водной среде. При этом вокруг каждой гранулы создается гидратированный слой с повышенной концентрацией активного начала, достаточной для уничтожения личинок комаров. Одновременно наличие такого стационарного слоя обеспечивает более медленную диффузию токсинов и спор с поверхности гранулы в окружающую среду, что позволяет значительно повышать срок работы препарата.

Эффективность препарата зависит от способности электризоваться как носителя, так и исходного полимера.

В табл. 1 приведены результаты испытаний различных носителей и полимеров.

Как видно из табл. 1, при использовании более полярных полимеров и электризуемых носителей время выхода активного начала в воду снижается (наличие более 3% активного начала в гранулах позволяет добиваться практически полной гибели личинок). Полученные результаты подтверждают предполагаемый механизм поведения биоларвицида в водной среде.

В результате применения изобретения удалось получить высокостабильный препарат, обеспечивающий гибель личинок комаров в подвалах, стоячих водоемах, болотах и т.п. условиях при сохранении экологических требований вследствие полной биодеградации органических и полной безвредности используемых неорганических компонентов.

Ранее биоларвициды подобного состава в литературе не описывались, так как и возможность получения структурированных биопрепаратов с использованием электризуемых компонентов, что свидетельствует о соответствии изобретения критериям новизны и изобретательского уровня.

Особенности получения и применения изобретения иллюстрируются примерами.

Пример 1 (выращивание активного начала). Штамм B101 выращивали на дрожже-полисахаридной среде (ДПС), содержащей 2% БВК, 2% соевая мука, pH 7,0-7,2, воды водопроводная. Условия глубинного культивирования: на круговой качалке (260 об/мин) в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 30 мл, при температуре 29-30^oC в течение 40-48 ч. Посевной материал - суспензия спор, полученная смывом культуры с картофельного агара.

Продуктивность штамма определяли методом серийных разведений с последующим высевом на МПА глубинным способом. Средний титр спор составлял - 3,5 • 10⁹ спор/см³.

Инсектицидная активность штамма определялась в отделе медицинской энтомологии Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского. Вирулентность штамма в отношении комаров Culex pipiens (ЛК₅₀) составляла 0,6 • 10³ спор/мл; в отношении Aedes aegypti - 4 • 10⁴ спор/мл.

Пример 2 (выращивание активного начала). Культивирование штамма B117 осуществляли в трехлитровом ферментере АНКУМ-203 на среде следующего состава: БВК - 2,45%; соевая мука - 1,6; вода водопроводная, pH исходное - 7,0.

Условия культивирования: аэрация - 0,6 объемов - объем среды поддерживается в период интенсивного размножения культуры и спорообразования; мешалка работает постоянно с начала режима (200-300 об/мин); температура культивирования (29 ± 1)^oC, время культивирования 40-48 ч. Титр спор и вирулентность определяли вышеуказанным способом (пример 1).

Титр спор составлял 1,2 • 10⁹ спор/мл, вирулентность (ЛК₅₀) на Culex pipiens - 0,3 • 10³ спор/мл.

Пример 3 (получение биоларвицида). 1 л культуральной жидкости, полученной по примерам 1, 2, помещали в роторную вакуум-выпарную установку RVO-64 при температуре выпаривания 60 ± 10^oC, разрежением 0,085 ± 0,005 МПа в течение 1 ч. Степень концентрирования составила 4 раза, после чего в концентрат вносили расчетные количества карбоксилметилцеллюлозы и направляли в сушилку кипящего слоя, на решетке которой был предварительно загружен вспученный перлит в количестве 4-6 г/см.

Сушку проводили при температуре в слое 80 ± 5^oC, расходе сжатого воздуха 3 дм³/м, времени контакта теплоносителя с биоматериалом 0,5-1,0 ч.

Высушенный материал подвергался испытаниям в условиях примера 6, 7.

Пример 4. Культуральную жидкость (1 л), полученную в условиях примера 2, подвергали концентрированию до 5 раз на половолоконной установке в режиме: скорость подачи КЖ в волокнах 0,6-0,8 м/с; площадь фильтрации - 8 м²; давление на входе аппаратов - 1,5 ± 0,1 кгс/см²; производительность фильтрации - 20 л/м² • ч.

После этого в концентрат вводили рассчитанное количество КМЦ и подвергали сушке в кипящем слое при температуре теплоносителя 75 ± 5^oC, расходе воздуха 2 дм³/мин и времени контакта 1,0-1,5 ч в присутствии перлита в количестве 4-6 г/см².

Результаты испытаний приведены в примерах 6, 7.

Пример 5. В условиях примера 3 проводили исследования по зависимости количества активного начала в гранулах препарата от условий сушки.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

Пример 6 (испытания биоларвицидов). Образцы биоларвицидов, полученные в примерах 3, 4, при содержании КМЦ 15%, СКК - 30%, перлита - 55% испытывали по отношению к личинкам комаров Culex pipiens.

Испытания проводили в кюветах площадью 12,6 дм² со слоев отстоянной водопроводной воды при температуре 23,5-24,5^oC.

Начиная со дня заполнения (0 день) и далее еженедельно вносили личинки комаров 4-й стадии в количестве 500 особей, а затем ежедневно вылавливали и подсчитывали куколок комаров.

Уровень гибели в контроле ≤ 15%.

Параллельно проводили опыты с препаратов бактокулицида в эффективной дозе.

Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Пример 7. Изучали влияние состава препаратов, полученных в условиях примера 3, с различными концентрациями КМЦП на скорость высвобождения биоларвицида.

Результаты испытания приведены в табл. 4.

Как следует из проведенных испытаний, полученные биоларвициды обладают в 6-10 раз более длительным ларвицидным действием по сравнению с известными.

Технология их получения достаточно проста и эффективна.

Препарат выпускается на Бердском заводе биопрепаратов, успешно прошел испытания в Индии, Вьетнаме, ряде других стран.

Источники информации
1. Bioscience, 1988, V. 38, N2, p. 80-83.

2. Инф. бюллетень ВПС МОББ, 1987, N2, с. 6-31.

3. Davidson E. W. et al. App. Env. Microbiol., 1984, V. 47, N 1, p. 125-129.

4. Патент США N 3430933, кл. А.о. N 15/00.

5. Патент США N 4563344, кл. A 01 N 25/26.

6. Англ. патент N 2127690, кл. A 01 N 25/26.

7. P. Myers et. all. Can. J. Microbiol. 1979, V. 25, p. 1227-1231.

8. ГОСТ 10832-91. Песок и щебень перлитовые вспученные.

Использование: изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам для борьбы с личинками комаров и способам их получения. Сущность: предложен препарат, содержащий 20 - 85% спор Bacillus sphaericus с токсинами и остатками культуральной жидкости, 5 - 40% полимера, содержащего полярные группы (производные целлюлозы, поливиниловый спирт) и неорганический пористый электризующийся материал (перлит, шлаки). Ларвицид получают введением полимера в концентрат культуральной жидкости, смешением с носителем и последующей сушкой с одновременной электризацией носителя. Представленный способ получения повышает длительность работы ларвицида по сравнению с известным с 1 - 4 недель до 6 - 12 мес и более. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Биоларвицид, содержащий водонерастворимый носитель и спорокультуральный комплекс Bacillus sphaericus, отличающийся тем, что он дополнительно содержит полимерный материал, содержащий полярные группы, а в качестве носителя - неорганический пористый электризующийся материал, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Спорокультуральный комплекс Bacillus sphaеricus - 20 - 85
Полимерный материал, содержащий полярные группы - 5 - 40
Неорганический пористый электризующийся материал - Остальное
2. Биоларвицид по п.1, отличающийся тем, что в качестве неорганического пористого электризующегося материала он содержит перлит. 3. Биоларвицид по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала он содержит производные целлюлозы. 4. Биоларвицид по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала он содержит поливиниловый спирт. 5. Способ получения биоларвицида, включающий культивирование бактериального начала, его концентрирование, смешение с носителем, полимерным материалом и последующую сушку, отличающийся тем, что в качестве бактериального начала используют спорокультуральный комплекс Bacillus sphaеricus, после его концентрирования вносят полимерный материал, затем смешивают с носителем и сушат с одновременной электризацией носителя. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что сушку проводят при повышенной температуре в "кипящем слое". 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что сушку проводят в течение 30 - 90 мин при 70 - 85^oC.