ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPHAERICUS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, АКТИВНОГО ПРОТИВ КОМАРОВ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано для создания биоинсектицида для борьбы с комарами, мошками и т.д. переносчиками ряда тяжелых заболеваний: малярии, филариозов, лихорадки Денге и т.п.

Интенсификация антропогенной деятельности во всех климатогеографических зонах земного шара приводит к резкому увеличению заболеваний, вызванных двукрылыми насекомыми. Особенно опасны в этом плане страны с влажным и тропическим климатом. Кроме перечисленных болезней, массу неудобств людям в крупных и мелких городах, фермерам и туристам доставляют кровососущие комары Culex. Местом выплода этих кровососов являются затопленные подвалы домов, пруды. Борьба с возбудителями вышеперечисленных болезней ведется, в основном, с помощью химических инсектицидов, которым присущ целый комплекс недостатков, в том числе, они не безвредны для рыб, гидробионтов и человека, к ним у насекомых возникает устойчивость, они загрязняют окружающую среду. Альтернативным является способ борьбы с двукрылыми насекомыми с использованием экологически чистых биологических препаратов на основе энтомопатогенных бактерий. В последние годы интенсивно создаются биоинсектициды, действующим началом которых служат эндотоксины белковой природы, синтезируемые спорообразующими бактериями Bacilus thuringiensis и Bacillus sphaericus. Эндотоксины имеют различный спектр инсектицидной активности и могут быть использованы против двукрылых насекомых различных отрядов как отдельно, так и в комплексе.

Целью настоящего патента является создание высокоактивного штамма Bacillus sphaericus, обладающего инсектицидной активностью против комаров рода Culex и Anopheles, с возможным созданием на основе споро-кристаллического комплекса данного штамма биоинсектицида для борьбы с кровососущими насекомыми.

В настоящее время в мире зарегистрирован препарат против кровососущих насекомых "Сферимос" (Дания), сделанный на основе спорокристаллической смеси штамма Bacillus sphaericus шт. 2362. В нашей стране зарегистрирован штамм-продуцент Bacillus sphaericus B101, на основе которого сделана препаративная форма в виде смачивающегося порошка (Россия). Этот штамм взят в качестве прототипа с наиболее близким техническим решением.

Нами получен штамм Basillus sphaericus НИИ генетика 16-S25 (ВКМП-В-6408), высокоактивный против комаров. Штамм синтезирует два белковых эндотоксина, летальных для двукрылых насекомых. Предложенный штамм может являться основой для создания нового эффективного биоинсектицида для борьбы с кровососущими насекомыми.

Заявляемый штамм имеет следующие характеристики:
1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 1-1,2 x 2-2,5 мкм. Сапрофит. Образует круглые споры и кристаллические включения на твердых и жидких питательных средах. На агаризованных средах через 24 ч роста образуют выпуклые блестящие колонии с ровными краями размером 3-4 мм.

При культивировании в жидких питательных средах (бульоне Хоттингера и т. д.) при аэрации штамм растет равномерно по всему объему.

При росте в богатых питательных средах, например в дрожже-полисахаридной среде (ДПС), pH 7,2, споро- и кристаллообразование завершаются к 48 ч культивирования при 26-30^oC и аэрации. Титр термоустойчивых спор при культивировании в ДПС 3 млрд. спор/мл. При культивировании данного штамма выход фага не наблюдается.

2. Физиолого-биологические признаки.

Штамм 16-S 25 не утилизирует сахара, растет на обычных средах. Режим культивирования 26-30^oC. Значения pH питательной среды для оптимального культивирования 6,8-7,2.

3. Генетические характеристики штамма.

Штамм устойчив к полимиксину 100 мкг/мл, стрептомицину 100 мкг/мл.

Кристаллические включения штамма состоят из белков с молекулярными массами 51 и 42 кDa.

4. Инсектицидные свойства.

Инсектицидные свойства штамма оценивали на личинках комаров лабораторной культуры Culex pipiens и Anopheles stephensi II возраста [1]
5. Способ получения штамма.

Штамм получен из природных источников. Инсектицидная активность штамма повышена путем многоступенчатой селекции.

Пример 1
Способ культивирования штамма.

Для культивирования штамма 16 S25 использовали дрожже-полисахаридную среду (ДПС). Состав дрожже-полисахаридной среды (ДПС), г/л:
Кормовые дрожжи (БВК) 30
Кукурузная мука 15
После стерилизации среды pH должна составлять 6,8-7,2. Засев среды производили с косяков в асептических условиях. После засева отбирали пробу для световой микроскопии для контроля концентрации (1%) и отсутствия посторонней микрофлоры. Культивирование проводили при температуре 30^oC с аэрацией 48 ч. Начиная с 24 ч, одновременно образовывались споры и кристаллы, связанные со спорой (80% спор и 20% вегетативных клеток). На 48 ч роста почти все клетки споруются; соотношение спора кристалл 1:1. Контроль за спорообразованием и кристаллообразованием производили светооптическим методом.

В результате ферментации концентрация жизнеспособных спор в культуральной жидкости составляла 3 млрд. спор/мл.

Пример 2.

Оценка эффективности штамма на личинках комаров Culex и Anopheles в лабораторных условиях.

Инсектицидные свойства предложенного штамма испытывали на личинках лабораторных культур комаров Culex pipiens и Anopheles stephensi II возраста. Показателем активности штамма служили концентрации культуры, вызывающие 50 и 90% гибель личинок (ЛК₅₀ и ЛК₉₀) в сравнении с известными штаммами продуцентами. В качестве эталона использовали штаммы, выделенные из коммерческих препаратов "Сферимос" (Дания) и "Сферикс" (Россия).

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из данных ЛК₅₀ (табл. 1), предложенный нами штамм 16-S25 действует на личинок комаров Culex pipiens более чем в 30 раз эффективнее, чем штамм, выделенный из препарата "Сферикс", и более 1,5 раз активнее штамма, выделенного из "Сферимоса", а на личинках Anopheles stephensi он эффективнее в три раза, чем штамм, выделенный из "Сферикса".

Пример 3.

Сохранность препаратов лиофилизированных культур Bacillus sphaericus.

Для экспресс оценки сохранности препаратов биологических инсектицидов использовали хранение при повышенной температуре (56^oC). Штаммы Bacillus sphaericus выращивали 48 ч в бульоне Хоттингера при 30^oC, культуральные жидкости подвергали сушке на установке NEW BRUNSWICK, B-71, USA. Полученные лиофилизированные порошки хранили в термостате при 56^oC в течение 30 дн. Результаты представлены в табл. 2.

Приведенные в табл. 2 данные показывают, что активность лиофилизированных препаратов штаммов 16-S25 и штамма из "Сферикса" при хранении в течение 30 дн при повышенной температуре снижается одинаково (8 и 7 раз соответственно), в то время как активность штамма из Сферимоса падает в 40 раз (приведенные цифры рассчитаны по ЛК₅₀). Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что предложенный нами штамм 16-S25 имеет относительно высокую способность к хранению при повышенной температуре.

ЛИТЕРАТУРА
Войцик А.А. Расницин Н.С. 11 Мед. паразит. и паразит. бол. 1992, N 4, с. 55-57.

Использование: микробиологическая промышленность, производство препаратов против комаров. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus sphaericus выделен из природных источников. Депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под N B-6408. Препарат против комаров получают культивированием штамма на дрожже-полисахаридной среде в течение 48 ч при температуре 30^oC. Москицидная активность штамма бактерий на личинках комаров Culex pipiens составляет: ЛК₅₀ - 0,005 мг/л, ЛК₉₀ - 0,01 мг/л. 2 табл.

Штамм бактерии Bacillus sphaericus ВКПМ В-6408, предназначенный для получения препарата, активного против комаров.