ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS № 7-1/23А, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С ЛАРВИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КРОВОСОСУЩИХ КОМАРОВ. Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим средствам защиты человека и сельскохозяйственных животных от объектов, являющихся переносчиками целого ряда опасных инфекций.

Общеизвестно вредоносное значение кровососущих комаров. Комары причиняют человеку и животным санитарно-эпидемиологический вред, являясь источником и переносчиком целого ряда опасных болезней: малярии, туляремии, желтой лихорадки, таежного энцефалита, лихорадки КУ, лихорадки Денге, филяриоза, анаплазмоза крупного рогатого скота и др. По данным ВОЗ - Всемирной организации здравоохранения в год регистрируется 150-200 млн. случаев малярии. В нашей стране малярия ликвидирована, но рост заболеваемости в мире при расширении международных связей и туризма требует постоянной профилактики и контроля численности малярийных комаров.

Комары и мошки в местах их массового обитания в значительной степени снижают производительность труда сельскохозяйственных рабочих, лесорубов, рыбаков, нефтяников, строителей и др. Эти кровососущие насекомые наносят также большой вред животноводству: уменьшают удои, продуктивность, яйценоскость, нередко происходит падеж (Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. Москва. ВО. Агропромиздат, 1989, 176 с.).

Борьба с кровососущими насекомыми ведется разнообразными способами, вплоть до нефтевания водоемов и обработки их универсальными высокотоксичными химическими препаратами - инсектицидами, что приводит к ряду отрицательных последствий - гибели рыб, птиц, лягушек, насекомых, непригодности водоемов для пользования (купания, водопоя, водоснабжения).

Эффективные химические средства борьбы с комарами и мошками вошли в явное противоречие с проблемой окружающей среды. Ученые всего мира стремились найти такие средства борьбы, которые действовали бы на комаров селективно, т.е. экологически безопасно. В результате в нашей стране и за рубежом было обращено внимание на возможность использования микробиологических методов борьбы с комарами.

К настоящему времени наибольшее применение получили препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis H₁₄ (BTH₁₄).

Bacillus thuringiensis H₁₄ - крупная грамположительная бацилла, образует споры и параспоральные кристаллические включения эндотоксина неопределенной формы, не образует термостабильного β-экзотоксина. Факультативный анаэроб. Токсическое действие оказывают кристаллы, споры и вегетативные клетки: эндотоксин, который содержится также в оболочке спор и вегетативных клеток, вызывает у личинок комаров деструктивные изменения клеточной стенки кишечника. Изучена ларвицидная активность споровой формы Bacillus thuringiensis H₁₄ на комарах Culex pipiens molestus. Высокие дозы (5·10⁴-5·10⁷ спор/мл) вызывают полную гибель личинок комаров в течение 1-4 часов. В лабораторных условиях в дозе 1·10⁵-4·10⁵ спор/мл в воде штамм сохраняет активность в течение 11 суток.

Известен штамм Bacillus thuringiensis (H₁₄) 266/2 из коллекции ССЕВ Института энтомологии Чехословацкой академии наук (Кандыбин Н.В. и др. Бактокулицид - эффективное биологическое средство борьбы с комарами / В кн.: Современные направления медицинской дезинсекции и дератизации. М., 1981).

В нашей стране на основе штамма 266/2 из коллекции ССЕВ (ЧССР) был создан ларвицидный препарат под названием «Бактокулицид», разработанный во Всесоюзном НИИ сельскохозяйственной микробиологии. Однако этот штамм не обладает стабильностью и при хранении диссоциирует с образованием гладких и шероховатых вариантов с пониженной продуктивностью, причем гладкие варианты полностью лишены вирулентности, а также спонтанно продуцируют вирулентный фаг в культуре.

Аналогичные препараты: Текнар, Вектобак, Москитур, Бактимос созданы в ряде других стран (США, Франция, Чехословакия) (Кандыбин Н.В. Ермолова В.П. Бактокулицид - эффективное экологически безопасное средство подавления численности кровососущих комаров. Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Вып.6. Краснодар, 2010, с.107-110).

Позже во Всесоюзном НИИ сельскохозяйственной микробиологии был выделен ряд отечественных изолятов Bacillus thuringiensis H₁₄, многие из которых по ларвицидной активности, продуктивности и стабильности превосходят штамм 266/2 (Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Барбашова Н.М. и др., 1986 г.; Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми: Теория и практика // Москва. ВО. Агропромиздат. - 1989 г., табл.39).

При этом длительное хранение на разных средах, периодические пересевы и массовое культивирование в больших емкостях выявили у некоторых штаммов Bacillus thuringiensis H₁₄, в т.ч. у штамма 266/2, постепенное снижение продуктивности и ларвицидной активности.

Селекционная работа во Всесоюзном НИИ сельскохозяйственной микробиологии позволила отобрать штамм 71 с повышенной продуктивностью, стабильностью и ларвицидной активностью - штамм Bacillus thuringiensis H₁₄ №71 (Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми: Теория и практика // Москва. ВО. Агропромиздат. 1989 г.). На основе этого штамма в 1983 г. был разработан способ получения ларвицидного препарата с наполнителем - хлористым натрием, превосходящего по своим показателям известный препарат на основе штамма 266/2 в 2,5-3 раза.

При этом продуктивность штамма при выращивании на дрожжеполисахаридной среде в 3 с лишним раза выше по сравнению со штаммом-прототипом 266/2. Сухой препарат на основе указанного штамма содержит 90·10⁹ спор/г. Ларвицидная активность препарата для личинок IV возраста Aedes aegypti составляет 0,12 мг/л.

В настоящее время в коллекции ВНИИСХМ имеются и другие штаммы Bacillus thuringiensis H₁₄ - продуценты бактокулицида.

Так, например, известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis серовар 14 №87 (Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми: Теория и практика // Москва. ВО. Агропромиздат. 1989 г.), депонированный в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии 12.03.1985 г. под регистрационным номером 72 ВНИИСХМ и перерегистрированный в связи с переходом на хранение методом криоконсервации 05.09.2011 г. под регистрационным номером RCAM 00501 (Справка о депонировании прилагается).

Штамм №87 выделен из аедогенного водоема в Ленинградской области, обладает выраженными энтомоцидными свойствами, безопасен для человека и теплокровных животных и пригоден для производства биопрепарата против комаров (прототип).

При культивировании на дрожжеполисахаридной среде штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis 87 образует в 1 мл культуральной жидкости не менее 3,0 млрд. жизнеспособных спор.

Ларвицидная активность, определенная по ЛК₅₀, составляет через 48 часов для личинок комаров Aedes communis (L₄) - 1,8·10³, а для Culex pipiens (L₂) - 4,2·10³. Для полного уничтожения личинок комаров родов Aedes, Culex, Anopheles достаточно дозы 2·10⁴-3·10⁵ спор и кристаллов эндотоксина.

Задачей заявляемого изобретения является получение штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis, обладающего более сильными ларвицидными свойствами и характеризующегося широким спектром эффективности против личинок кровососущих комаров, пригодного для создания высокоэффективного ларвицидного препарата.

Задача решается тем, что в качестве средства для получения ларвицидного препарата с высокой активностью против кровососущих комаров используют штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis №7-1/23 A.

Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis №7-1/23 А (BTH₁₄ №7-1/23 A) выделен из анофелогенного водоема в Ленинградской области и депонирован 26.08 2011 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM00626 (Справка о депонировании прилагается).

Штамм BTH₁₄ №7-1/23 А обладает выраженными ларвицидными свойствами против комаров и характеризуется широким спектром эффективности против личинок кровососущих комаров родов Aedes, Culex, Anopheles.

Штамм BTH₁₄ №7-1/23 А характеризуется следующими свойствами.

Грамположительные палочки с перитрихиальным типом жгутикования, подвижные, размером (3-4)×(0,8-1,1) мкм и параспоральные включения неправильной формы и разной величины; 0,2-1,2 мкм.

На рыбном агаре (РА) через 48 часов роста колонии матовые, мелкошероховатые, плоские, со слегка волнистым опушенным краем, вязкой консистенции, серовато-белые, диаметром 0,9-1,9 см.

При посеве штрихом через 5 суток инкубации при 28°C на РА штрих растет обильно, поверхность матовая, консистенция вязкая, запах специфический. Окраска питательной среды не изменяется.

При культивировании в жидких питательных средах штамм растет при температуре 20-36°C (оптимум 28-32°C) и при показателе кислотности среды рН 6,2-8,0 (оптимум 6,7-7,3) со встряхиванием на качалке 220 об/мин.

На рыбно-пептонном бульоне через сутки инкубации при 28°C образуется поверхностная пленка, на пятые сутки - помутнение и осадок.

Факультативный анаэроб

Биохимические свойства

Культура образует аммиак, продуцирует ацетилметилкарбинол и лецитиназу, не расщепляет эскулин, не образует сероводород и уреазу. Восстанавливает нитраты, разжижает желатину по всему столбику на 5-е сутки. Молоко пептонизирует, лакмус обесцвечивает.

Отношение к углеводам

Сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, левулезу, трегалозу, глицерин, крахмал, не сбраживает сахарозу, ксилозу, лактозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, раффинозу, маннозу, дульцит, сорбит, маннит, инсулин, салицин.

Хорошо развивается на средах, содержащих органический азот: пептон, рыбный бульон, дрожжи кормовые.

Антигенные свойства

Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. israelensis (идентифицирован по этой реакции и по классификации Bacillus thuringiensis (1962, 1967, 1990) H. de Barjac). По серологическим свойствам относится к 14 серотипу Bacillus thuringiensis.

Не образует термостабильного экзотоксина.

Чувствительность штамма к фагам проверялась путем титрования фагов на газонах испытуемой и контрольной культуры. Использовались фаги культур Bacillus thuringiensis, наиболее часто встречающиеся при промышленном производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов. Штамм BTH₁₄ №7-1/23 А устойчив к действию 9 фагов, наиболее распространенных в производстве биопрепаратов: К, М, Н, Э-5, И-77, Д₂-Д₅.

По показателям вирулентности, токсичности и токсигенности штамм BTH₁₄ №7-1/23 А не патогенен для теплокровных животных, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованием, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Штамм BTH₁₄ №7-1/23 А растет на дрожжеполисахаридных средах, в состав которых входят кукурузная мука и кормовые дрожжи.

Штамм хранится на скошенном рыбном агаре в пробирках при 4-5°C с периодическим пересевом 1 раз в 6 месяцев, в лиофильновысушенном состоянии в запаянных ампулах и методом криоконсервирования в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM).

Продуктивность заявляемого штамма BTH₁₄ №7-1/23 А и штамма-прототипа BTH₁₄ №87 определяли путем ферментации соответствующей культуральной жидкости в ферментере объемом 100 л с последующим подсчетом выросших колоний бактерий штаммов. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Продуктивность штаммов BTH₁₄ Штамм Период времени до завершения ферментации, ч Споры/кристаллы эндотоксина Титр спор, млрд/мл КЖ BTH₁₄ №87 59 1,35:1 3,1 BTH₁₄ №7-1/23 А 51 1:1 4,52

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что технологичность (титр спор) заявляемого штамма BTH₁₄ №7-1/23 А на 45% выше, чем у штамма-прототипа BTH₁₄ №87, больше доля образованного кристаллического эндотоксина, ответственного за эффективность штамма, и при этом процесс ферментации (образование спор и кристаллов) закончился на 8 часов раньше, что является экономически более выгодным за счет сбережения энергозатрат.

Были проведены лабораторные опыты по оценке ларвицидной активности штамма BTH₁₄ 7-1/23А в сравнении со штаммом-прототипом BTH₁₄ 87.

Ларвицидную активность определяли по ЛК₅₀ (концентрации числа спор/мл, вызывающей 50% гибель тест-объекта при свободном поглощении личинками спор и кристаллического эндотоксина из водной суспензии препарата).

Сначала готовили водную суспензию в пяти концентрациях, обеспечивающих от 10 до 96% гибели тест-объекта. Так, например, для получения 1%-ной концентрации суспензии смешивали 1 мл культуральной жидкости (КЖ) с 99 мл водопроводной воды и тщательно встряхивали в течение 2-х минут. Рецептура используемых в опытах разведений при исходном титре бактерий штамма BTH₁₄ 4×10⁹ спор/мл КЖ приведена в таблице 2.

Таблица 2 Рецептура разведений КЖ № КЖ (мл) + вода (мл) % суспензии Кол-во спор/мл 1 1+99 1,0 4×10⁷ 2 1+99 0,01 4×10⁵ 3 5+95 0,5×10^-3 20×10³ 4 50+50 0,25×10^-3 10×10³ 5 25+75 0,125×10^-3 5×10³ 6 12,5+87,5 0,06×10^-3 2,5×10³ 7 6,25+93,75 0,03×10^-3 1,25×10³

Все разведения готовили на отстойной водопроводной воде. Опыт ставили в чашках Петри с 50 мл водной суспензии культуральной жидкости, куда помещали по 25 личинок комаров рода Aedes и Culex, а также в стеклянных банках емкостью 250 мл со 100 мл суспензии, куда помещали по 25 личинок комаров рода Anopheles. В опытах использовали дозы: 20,0; 10,0; 5,0; 2,5; 1,25 тысяч спор/мл суспензии. В качестве корма в каждую чашку или банку добавляли по 2 капли 5% водной суспензии кормовых дрожжей. В контроле личинок подсаживали в отстойную воду без препарата. Чашки и банки помещали в термостат при температуре 28°C на 24 часа, после чего учитывали гибель личинок комаров. Для сравнения в опытах при тех же условиях, при тех же концентрациях использовали суспензию штамма-прототипа BTH₁₄ 87.

Гибель личинок комаров для каждого штамма по каждому варианту разведений КЖ определяли с учетом гибели личинок в контроле по формуле:

Гибель личинок (%)=(M₀-М_к)К_исх×100, где

M₀ - гибель личинок в опыте (среднее значение),

М_к - гибель личинок в контроле (среднее значение),

К_исх - исходное количество личинок в опыте (среднее значение).

Полученные данные использовали для определения ЛК₅₀ (дозы, вызывающей 50% гибели личинок).

Значение ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (см. монографию «Экология Bacillus thuringiensis» авторов В.Ф. Патыка, Т.И. Патыка. Киев, изд. ПГАЛ, 2007 г., 217 стр.):

lg ЛК₅₀=lg С_м-δ(∑L₁-0,5), где:

С_м - максимальная концентрация испытуемой суспензии культуральной жидкости в тыс. клеток (в данном случае 20 тыс. кл.);

δ - логарифм кратности разведения (логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей);

∑L₁ - сумма отношений числа личинок, погибших от данной концентрации к общему числу личинок, подвергшихся воздействию этой концентрации (с учетом поправки на гибель личинок в контроле).

Результаты ларвицидной активности (значение ЛК₅₀) заявляемого штамма BTH₁₄ 7-1/23 А и штамма-прототипа BTH₁₄ 87, полученные в лабораторных опытах по отношению к различным видам кровососущих комаров, представлены в таблице 3.

Таблица 3 Ларвицидная активность штаммов BTH₁₄ для различных видов кровососущих комаров Виды комаров Возраст личинок ЛК₅₀ (тысяч клеток/мл суспензии штаммов BTH₁₄) через 24 ч Увеличение ларвицидной активности, % Штамм 7-1/23 А Штамм 87 Aedes aegypti IV 3,3 4,46 35 Aedes flavescens II 2,6 3,42 32 Aedes flavescens IV 3,75 4,8 28 Aedes communis III 1,88 2,0 06 Aedes communis IV 3,66 4,32 18 Aedes punctor IV 3,07 3,68 20 Aedes caspius IV 4,78 6,5 36 Aedes dorsalis IV 2,96 4,08 38 Aedes dorsalis III 2,84 3,16 21 Aedes cataphylla II 2,66 3,32 25 Aedes leucomelas II 2,8 3,15 18 Aedes excrucians IV 3,45 4,42 28 Culex pipiens molestus II 1,8 4,2 44 Culex pipiens molestus IV 4,26 5,95 38 Anopheles stephensi II 6,27 9,1 45 Anopheles atroparvus II 8,24 12,2 48 Anopheles saccharovi II 6,71 9,4 40 Anopheles maculipennis II 7,34 10,2 39

Из приведенных в таблице 3 данных следует, что заявляемый штамм, как и штамм-прототип, активен против 14 видов комаров родов Aedes, Culex, Anopheles, причем личинки младших возрастов являются более восприимчивыми, а также что заявляемый штамм BTH₁₄ 7-1/23 А по ларвицидной активности на 28-45% эффективнее штамма-прототипа BTH₁₄ 87.

На основе штамма BTH₁₄ №7-1/23 А разработана технология получения ларвицидного (энтомоцидного) препарата.

Пример получения препарата на основе штамма BTH₁₄ №7-1/23 А.

Сначала в колбах (1 л) приготовили дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава, %: мука кукурузная - 2,4; дрожжи кормовые - 2,0; (NH₄)₂HPO₄ - 0,5; CaCl₂×2H₂O - 0,15; MgSO₄×H₂O - 0,05; остальное - вода. Перед стерилизацией рН питательной среды 7,6-7,8.

Подготовленную среду разлили в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл по 40-50 мл в каждую и стерилизовали в автоклаве при температуре 120-125°C в течение 30 минут. После стерилизации рН среды 6,8-7,2. Стерильную питательную среду охладили до 30-34°C и засеяли культурой штамма из пробирки, для чего в пробирку с культурой на скошенном РА внесли 5-8 мл стерильной воды или физиологического раствора. Этой же пипеткой осторожно растерли культуру, встряхнули до гомогенной суспензии и внесли в колбы по 0,2-0,5 мл. Культуру в колбах выращивали на качалке 220-250 об/мин и температуре 28-30°C в течение 56-72 часов до полного высыпания спор и образования кристаллов эндотоксина (контроль осуществляли микроскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BTH₁₄ №7-1/23 А использовали для засева среды в ферментерах.

Для выращивания культуры в ферментере использовали дрожжеполисахаридную среду, лучше того же состава, который был использован для получения культуральной жидкости в колбах Эрленмейера (состав указан выше).

В ферментере любой емкости, заполненной на 50% водой, сначала растворили соли, затем при постоянно работающей мешалке внесли кормовые дрожжи и кукурузную муку и перемешивали в течение 20 мин. Довели рН среды до 7,8-8,0 с помощью 40% едкого натра, нагрели до 80-85°C, выдерживая температуру в течение 30 минут, затем стерилизовали при 1 атм в течение 1 часа, после чего охладили до температуры 32-34°C. Перед внесением посевного материала из ферментера брали пробу среды для контроля стерильности. При просмотре под микроскопом в поле зрения не должно быть наличия микроорганизмов.

После этого в питательную среду в ферментере внесли 1-2% культуральной жидкости из колб Эрленмейера.

Процесс выращивания культуры в ферментере вели при 28-30°C, непрерывном перемешивании среды при помощи мешалки 250 об/мин, давлении в ферментере 0,3-0,4 атм и соответствующей аэрации:

с 0 до 3 час - только перемешивание;

с 3 до 18 час - 0,5·V возд./V среды/мин;

с 18 до 42 час - 1,0·V возд./V среды/мин;

с 42 час до окончания ферментации - 0,5·V возд./V среды/мин.

Через 36-42 часа в случае сильного вспенивания в период высыпания спор снижали аэрацию воздухом до 0,1·V возд./V среды/мин.

Процесс ферментации проводили в условиях высокой аэрации и закончили при достижении содержания свободных спор и кристаллов эндотоксина до 70-80% от общего количества включений и при их соотношении 1:1.

Таким образом был получен препарат на основе штамма BTH₁₄ №7-1/23 А, представляющий собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения любой серийной опрыскивающей аппаратуры. Технология его производства не требует больших энергозатрат, необходимых для получения препарата сухой формы.

Эффективность препарата на основе заявляемого штамма BTH₁₄ 7-1/23 А, полученного описанным выше способом, а также препарата на основе штамма-прототипа BTH₁₄ 87 была проверена экспериментально в закрытых водоемах подвалов жилых домов. Наличие затопленных подвалов жилых домов в городских условиях мегаполисов создает экологическую основу для круглогодичного выплода кровососущих комаров. Доминантным видом закрытых водоемов являются комары вида Culex pipiens molestus.

Перед обработкой определяли площадь водоемов, количество личинок на 1 м² водной поверхности и соотношение их по возрастам. Готовили рабочие суспензии на основе 3-х доз препарата: 0,25 мл/м²; 0,5 мл/м²; 0,75 мл/м². Водную поверхность каждого водоема обрабатывали препаратом на основе заявляемого штамма BTH₁₄ 7-1/23 А, полученного описанным выше способом, или препаратом на основе штамма-прототипа BTH₁₄ 87 соответствующей концентрации с помощью обычного опрыскивателя. Погибших личинок комаров учитывали через 72 часа после обработки. Результаты опытов приведены в таблице 4

Таблица 4 Эффективность препаратов на основе штамма BTH₁₄ в затопленных подвалах против личинок комаров вида Culex pipiens molestus Доза препарата, мл/м² Площадь обработки, м² Численность личинок на 1 м² воды до обработки % гибели через 72 часа после обработки BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 0,25 18 15 760 610 90,2 66,4 0,5 28 24 620 580 96,4 75,0 0,75 16 11 510 470 98,6 82,4 Контроль 5 436 Увеличение численности

Данные таблицы 4 показывают высокую эффективность препарата на основе штамма BTH₁₄ 7-1/23 А против личинок Culex pipiens molestus в подвалах домов даже в самых низких дозах применения (0,25 мл/м²). При этом гибель личинок составляла 90,2% и была на 23,8% выше по сравнению с препаратом на основе штамма-прототипа BTH₁₄ 87.

Эффективность препарата на основе заявляемого штамма BTH₁₄ 7-1/23 А и препарата на основе штамма-прототипа BTH₁₄ 87 была также проверена в открытых водоемах садов и парков, т.е. в местах массового отдыха населения.

Доминантными видами кровососущих комаров в открытых водоемах являются представители рода Aedes (в первую очередь Aedes communis), а также рода Anopheles (Anopheles maculipennis - малярийный комар).

Личинки рода Aedes заселяют воронки, лужи, ямы, канавы, каналы ранней весной, после таяния снега. Массовое их отрождение в условиях средней полосы наблюдается с конца апреля по первую декаду июня. Личинки Anopheles maculipennis в Ленинградской области в первой декаде июня заселяют в основном прибрежную часть прудов и водоемов, заросших растительностью.

Опыты проводили по методике, описанной выше с использованием различных доз расхода препаратов на 1 м² водной поверхности.

Погибших личинок комаров учитывали через 72 часа после обработки.

В таблице 5 представлены результаты исследований по эффективности препаратов на основе штамма BTH₁₄ против личинок рода Aedes и Anopheles.

Таблица 5 Эффективность препаратов на основе штамма BTH₁₄ 7-1/23 А в открытых водоемах Ленинградской обл. против личинок комаров Aedes и Anopheles Расход препарата на 1 м², мл Обработанная площадь, м² Численность личинок на 1 м² воды до обработки % гибели через 72 ч после обработки BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 BTH₁₄ 7-1/23 А BTH₁₄ 87 Aedes communis 0,25 120 150 158 132 92,8 78,6 0,5 86 116 142 118 100 82,1 0,75 140 168 216 190 100 83,3 Anopheles maculipennis 0,5 156 164 148 182 94,8 73,0 0,75 174 168 242 210 96,6 81,8 1,0 110 112 220 178 98,4 84,8

Данные таблицы 5 показывают высокую эффективность препарата на основе штамма BTH₁₄ 7-1/23 А против личинок комаров рода Aedes и Anopheles в открытых водоемах: доза 0,25-0,5 мл препарата на 1 м² водной поверхности обеспечивает 92,8-100% гибели личинок Aedes communis, а доза 0,5-0,75 мл препарата на 1 м² водной поверхности - 94,8-96,6% гибели личинок малярийных комаров Anopheles maculipennis. При этом гибель личинок комаров на 18-30% выше по сравнению с препаратом на основе штамма-прототипа BTH₁₄ 87.

Безопасность для теплокровных животных

В соответствии с Методическими указаниями Минздрава СССР №4263-87, №2620-82 и с учетом рекомендаций ВОЗ (Бюлл. ВОЗ, 1981, №6, с.20-27) на беспородных белых крысах и беспородных белых мышах изучены вирулентность, диссеминация, токсичность и токсигенность штамма BTH₁₄ №7-1/23 А.

Вирулентность и диссеминацию штамма изучали при однократном введении суточной агаровой культуры в физиологическом растворе в желудок белым мышам и белым крысам в дозах по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ и внутрибрюшинно по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ микробных клеток (мк.кл.) на животное. В опыте использовали по 12 животных на дозу (6 самцов и 6 самок). В период наблюдения клинических симптомов заболеваний животных не наблюдалось, гибель отсутствовала. Через 30 суток после введения культуры микроорганизмов, животных умерщвляли ингаляцией CO₂ и методом отпечатков делали посев из крови и внутренних органов (легких, печени, почек и селезенки) на чашки Петри с агаризованной средой. Рост культуры в высевах из органов животных при обоих способах введения не обнаружен.

Токсичность штамма оценивали путем внутрибрюшинного введения мышам взвеси агаровой культуры микроорганизмов, приготовленной на стерильном физиологическом растворе и инактивированной нагреванием при 60°С в течение 30 минут в концентрациях 10⁷, 10⁸ и 10⁹ (мк.кл.) на животное (по 6 особей на дозу). В течение срока наблюдения - первых двух суток - гибели мышей не было.

Токсигенность штамма оценивали путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения стерильного фильтрата культуральной жидкости (фильтрация через фильтр Millipor с размером пор 0,22 мкм) и 3- и 7-суточных культур в дозах 0,3 мл, 0,6 мл и 1,0 мл (по 6 особей на дозу). Животным контрольных групп вводили стерильную жидкую питательную среду в таких же объемах. Гибели мышей не было. ЛД₅₀ не установлена. При обоих способах введения она превышает 1,0 мл на животное для 3- и 7-суточных культуральных жидкостей.

То есть по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus thuringiensis H₁₄ №7-1/23 А не патогенен для теплокровных животных и, в соответствии с «Методическими указаниями…» №2620-82 и №4263-87, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Результаты по безопасности данного биопрепарата согласуются с мировой практикой широкого использования биоинсектицидов на основе Bacillus thuringiensis.

Таким образом, приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что заявляемый штамм BTH₁₄ 7-1/23 А и препарат на его основе обладает высокой ларвицидной активностью против личинок кровососущих комаров, характеризуется безопасностью для человека и теплокровных животных.

А это характеризует штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis №7-1/23 A (BTH₁₄ №7-1/23 А) как перспективный в качестве средства для производства эффективного ларвицидного биопрепарата против кровососущих комаров.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам защиты человека и сельскохозяйственных животных от кровососущих комаров. Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis № 7-1/23А обладает ларвицидными свойствами. Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis депонирован в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM00626 в группе споровых микроорганизмов. Может быть использован при создании ларвицидного биопрепарата против кровососущих комаров. Изобретение позволяет повысить гибель кровососущих комаров. 5 табл., 1 пр.

Штамм Bacillus thuringiensis var. israelensis № 7-1/23А, депонированный в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM00626 в качестве средства для получения препарата с ларвицидной активностью против кровососущих комаров.