СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ИЗ МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/62 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов, и может быть использовано в гематологии, биотехнологии, медицинской промышленности, ветеринарии.

Известен способ получения стабильного аналога простациклина бактериальной природы, взятый в качестве прототипа [1].

Он включает забор крови из медицинской пиявки, инкубирование ее в питательной среде, пересев выросших колоний бактерий, собирание клеток, разрушение ультразвуком суспензированных в дистиллированной воде клеток, диализ недостаточной жидкости.

Но данный способ имеет следующие недостатки: он трудоемок, требуется много времени на его осуществление, конечный продукт, получаемый данным способом, неоднороден, т.е., простагландины получают не в гомогенном состоянии.

Целью изобретения является сокращение времени получения простагландинов, снижение трудоемкости способа и получение простагландинов в гомогенном состоянии.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор гомогената или порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок прогревают в кипящей водной бане не менее 3 мин, центрифугируют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Пример 1. Готовят водный экстракт Пиявита /лиофилизированного порошка медицинских пиявок/: 100 мг Пиявита суспендируют в 4 мл H₂О, инкубируют 30 мин при 37^oC, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин (или фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр). Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. В остывший до комнатной температуры раствор вносят трипсин и химотрипсин в конечной концентрации 10 мг/мл при pH 8,0 и оставляют на 10 ч (ферментативный гидролиз). По окончании инкубации экстрагируют этилацетатом в течение 20 мин при постоянном встряхивании, собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Для тестирования активности сухого остатка суспензируют его в H₂O дист. при pH 8,0 - 8,5. Центрифугируют и анализируют надосадочную жидкость. Конечный продукт не содержит полипептидных цепей и аминокислот (отрицательные спектрофотометрический и нингидриновый тесты). Содержит простагландины в количестве 25,0 нг/мл и блокируют агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ на 100%.

Пример 2. Берут 20 медицинских пиявок, измельчают в гомогенизаторе, экстрагируют дист. H₂О и центрифугируют. Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 5 мин. В охлажденный до комнатной температуры раствор вносят едкий натр (NaOH) до конечной концентрации 2H, инкубируют в течение 12 ч (щелочной гидролиз).

В раствор вносят двукратный объем хлороформа и экстрагируют 20 мин при постоянном встряхивании. Собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Сухой остаток растворили в 0,5 М фосфатном буфере pH 7,5. Конечный продукт не содержит и лиопептидных цепей и аминокислот (отрицательные спектрофотометрические и нингидриновый тесты), содержит ппростагландины в количестве 23,0 нг/мл и блокирует агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ, на 100%.

При прогревании надосадочной жидкости в кипящей водной бане менее 3 мин получают конечный продукт с низким содержанием простагландинов, что объясняется тем, что большая часть простагландинов находится в связанном состоянии с белками дистабилазного комплекса, обеспечивая им термостабильность и защиту от гидролитического действия трипсина и химотрипсина. Таким образом, большая часть простагландинов остается в водной фракции после экстрагирования этилацетатом, поскольку связаны они с неуспевшими денатурироваться за такое время кипячения белками дистабилазного комплекса.

Методы тестирования содержания и активности простагландинов, выделенных из медицинских пиявок.

1. Количественный метод: используют набор реактивов для радиоимунологического анализа.

2. Качественный метод: ингибирование агрегации тромбоцитов. Готовят плазму крови (теплокровных животных), богатую тромбоцитами [1, 2], для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 10 мин при 500 об/мин, собирают плазму, богатую тромбоцитами. Далее цитратную кровь центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, собирают плазму, лишенную тромбоцитов, которую используют в качестве фоновой крови при спектрофотометрическом определении агрегации тромбоцитов при длине волны 600 нм по методу Борна [2].

Предлагаемый способ достаточно прост и позволяет получить простагландины в чистом виде.

Источники информации, принятые во внимание
1. Авт. св. 1473136, кл. A 61 K 35/14.

2. Лейтин В.Л., Свиридов Д.Д. Модельная система для изучения взаимодействия тромбоцитов с клеточными макромолекулярными компонентами сосудистой стенки in vitro. В кн.: Стенка сосудов в атеро- и тромбогенезе, М, 1983, 155 - 175.

3. Hutton R. A., Howard M.A., Deykin D., Hardisty R.M. Methods for the separation of platelets from plasme. Thromb. Diath. Haemost., 31, 119 - 132, 1974.

4. Born G. V., Grese H.J. Aggregation of blood platelets. J. Physiol., 168, 178 - 188, 1963.

Изобретение предназначено для получения биологически активных препаратов из медицинской пиявки. Водный раствор гомогената или лиофильно высушенных медицинских пиявок прогревают в кипящей водной бане не менее 3-х минут, центрифугируют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают ее до сухого остатка. Способ обеспечивает получение простагландитов в гомогенном состоянии и сокращает время получения.

Способ получения простагландинов из медицинской пиявки, включающий гомогенизацию пиявок, экстрагирование гомогената, отделение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что водный раствор гомогената или порошка лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной бане не менее трех минут, центрифугируют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают до сухового остатка.