СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕСТАБИЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА - ПРИРОДНОЙ ЛИПОСОМЫ, СИНТЕЗИРУЕМОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКОЙ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/32 

Изобретение относится к медицине и может применяться в гематологии, биохимии, медицинской, и биохимической промышленности.

Известен способ получения дестабилазы из медицинской пиявки, взятый нами в качестве прототипа [4] . По данному способу сырьe обрабатывают, очищают методом аффинной хроматографии, элюируют целевой продукт, нейтрализируют и лиофилизируют.

Однако связывание с лизином связывающих участков дестабилазы подобно "кринглом" плазминогена приводит к получению дестабилазы, не стабильной при прогревании 80^oC в течение 15 мин, т.е. происходит выпадение в осадок дестабилазы (денатурация) и снижение содержания простагландина. Дестабилаза претерпевает конформационные изменения, в результате чего белковая часть дестабилазы теряет способность к комплексообразованию с гидрином и ингибитором калликреина.

Цель изобретения - получение стабильного комплекса, при агрегировании мономеров которого образуется прочная, термостабильная липосома.

Поставленная цель достигается тем, что аффинную хроматографию проводят на L-глутамине, иммобилизированном на водонерастворимом носителе,
Липосома проявляет свои свойства как в водных, так и в органических растворителях, т. е. пространственно изменяет свою ориентацию, экспонируя или гидрофильную, или гидрофобную часть. Гидрофобные свойства липосомы обусловлены липидным компонентом - простагландинами, тогда как гидрофильные - белковой структурой дестабилазы, гирудина и ингибитора калликреина [2].

Мономер липосомы - комплекс с ММ 25000 Да, стабилен при различных биохимических обработках: диализе, электрофорезе, гельфильтрации, щелочном гидролизе, выдерживает прогревание при 80^oC в течение 15 мин. Мономеры имеют большое сходство между собой, что обуславливает их агрегаторную способность и в конечном итоге приводит к формированию липосомы.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используют секрет слюнных желез пиявок или экстракт лиофильно высушенных пиявок, или гомогенаты отдельных частей тела пиявок. Аффинную хроматографию проводят на L-глутамине, иммобилизованном носителе (L-глутамин-агароза, L-глутамин-сефароза и т.д., элюируют целевой продукт буферными растворами с pH 3,0-5,0 и pH 8,0-10), c прототипом одна элюция - pH 3,0-5,0, нейтрализируют полученные элюаты, соединяют и лиофилизируют. Последовательность элюирующих буферов на выход целевого продукта не влияет.

Приводим конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. Колонку, наполненную 20 мл L-глутамин-агарозы, уравновешивают дистиллированной водой. Наносят 10 мл секрета слюнных желез пиявок, далее промывают от несвязавшихся компонентов дистиллированной водой. Первую элюция проводят раствором уксусной кислоты с pH 3,2. Собирают элюат. Вторую элюцию проводят 0,05 М Трис-HCl буфером pH 8,3. Собирают элюат, объединяют элюаты, нейтрализуют pH и лиофилизируют.

Конечный продукт обладает фибринолитической активностью, блокирует агрегацию тромбоцитов, ингибирует тромбин и калликреин плазмы крови (таблица).

Пример 2. На колонку, наполненную 20 мл L-глутамин-агарозы наносят 30 мл водного экстракта порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок. Промывают колонку дистиллированной водой. Первую элюцию проводят 0,05 М Трис - HCl буфером pH 9,8, промывают дистиллированной водой, затем элюируют раствором уксусной кислоты pH 5,0. Собирают элюаты, нейтрализируют и определяют активность конечного продукта (таблица).

Пример 3. Все процедуры проводят, как указано в примере 2. Элюирование конечного продукта осуществляют раствором уксусной кислоты с pH 2,5 и 0,05 М Трис-HCl буфером pH 7,8.

Конечный продукт не обладает активностью (таблица).

Пример 4. Все процедуры проводят, как указано в примере 2. Элюирование осуществляют раствором уксусной кислоты с pH 5,0 и 0,05 М Трис-HCl буфером pH 10,5.

Конечный продукт не обладает активностью (таблица).

Для тестирования целевых продуктов использованы методы:
1. Спектрофотометрическое определение концентрации белка.

2. Фибринолитическая активность на пластинах стабилизованного фибрина.

3. Тромбиновое время.

4. Время рекальфикации плазмы крови.

5. Агрегация тромбоцитов.

Данный способ позволяет получить препарат, обладающий не только тромболитическим, но и защитным противотромботическим действием, эффективным не только при внутривенном, но и при пероральном введении.

Таким образом, при обработке конечного продукта, связанного с глутамин-агарозой, раствором уксусной кислоты при pH меньше 3,0 происходит инактивация дестабилазы на 50%, простагландинов на 85%, гирудина на 100% и ингибитора калликреина на 90%. То же самое происходит при использовании элюирующего буфера с pH более 10.

Применение элюирующих буферов со значениями от 5,0 до 8,0 не приводит к разрушению связи между конечным продуктом и глутамином, иммобилизованном на водонерастворимом носителе.

Изобретение относится к медицине и может применяться в гематологии, биохимии, медицинской и биохимической промышленности. Для получения комплекса, при агрегировании мономеров которого образуется липосома, синтезируемая медицинской пиявкой, производят очистку обработанного сырья путем аффинной хроматографии на L-глутамине, иммобилизованном на водонерастворимом носителе. Технический результат - получение прочного термостабильного комплекса дестабилазы, простагландина, гирудина и ингибитора калликреина. 1 табл.

Способ получения дестабилазного комплекса, включающий очистку обработанного сырья путем аффинной хроматографии, элюирование буферными растворами, нейтрализацию элюата с последующей лиофилизацией, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на L-глутамине, иммобилизованном на водонерастворимом носителе.