ВОДНЫЙ РАСТВОР ИНТЕРФЕРОНА Российский патент 1998 года по МПК A61K9/08 A61K38/21 

Изобретение относится к водному раствору интерферона-альфа, пригодному для парентерального введения. Производство растворов интерферона связано с многочисленными проблемами, обусловленными чувствительностью действующего ингредиента к воздействию физических и химических факторов, которые до настоящего времени не нашли удовлетворительного решения.

Подобно другим протеинам интерферон в водных растворах подвержен механизмам химического разложения, таким как протеолиз, окисление, дисульфидный обмен, олигомеризация, деаминирование и бета-элиминирование, и физическим механизмам, таким как агрегация, осаждение и адсорбция. Поэтому растворы интерферона содержат добавки, которые противодействуют этим эффектам. Например, в торговых препаратах в качестве стабилизатора используют сывороточный альбумин человека (HSA - human serum albumin), однако это связано с проблемами опасности вирусного заражения и образования агрегатов, что в свою очередь может привести к образованию антител. Поэтому были предложены растворы интерферона, в которых не используется HSA и которые содержат другие вспомогательные агенты, в том числе неионогенные детергенты (международная заявка WO 89/04177 и японский патент 61-277633). Кроме того, известно, что сохранение определенных значений pH важно для стабильности растворов интерферона. Например, в заявке WO 89/04177 указан диапазон значений pH 4,0-6,0. Наконец, так же как и для других инъекционных растворов, могут быть необходимы другие эксципиенты, например, агенты для регулирования изотонического раствора и консерванты.

Поскольку интерферон является высоко активным и присутствует в фармацевтических препаратах в минимальной концентрации, стабильность препаратов с интерфероном и обеспечение постоянной концентрации действующего ингредиента чрезвычайно важны. Было установлено, что для того чтобы обеспечить оптимальные потребительские свойства, эксципиенты раствора интерферона должны быть тщательно отобраны из множества потенциально пригодных агентов и хорошо сочетаться друг с другом. Например, адсорбция интерферона-альфа-2а на стеклянных поверхностях является максимальной при pH 5-6, поэтому данное значение pH представляется в принципе неблагоприятным. С другой стороны, реакции ковалентного разложения происходят в минимальной степени при данном значении pH. Торговые HSA-стабилизированные растворы имеют значение pH 7. На потребительские свойства растворов интерферона оказывают воздействие непредсказуемым образом и многие другие некоррелирующие друг с другом факторы.

Более близким к изобретению является водный раствор интерферона для парентерального введения, описанный в EP 440100 и содержащий интерферон-альфа, буфер, бензиловый спирт.

Задача изобретения заключается в получении стабильных растворов.

Поставленная задача решается тем, что водный раствор интерферона, содержащий интерферон-альфа, буфер, бензиловый спирт согласно изобретению дополнительно содержит неионогенный детергент и содержит буфер для установления pH 4,5-5,5 при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
Интерферон-альфа, межд.ед. - 10⁶-10⁸
Неионогенный детергент, мг - 0,01-0,5
Буфер для установления pH 4,5-5,5, мМ - 10-15
Бензиловый спирт, мг - 8-20
Предпочтительно раствор дополнительно содержит вещество, придающее изотоничность раствору.

Предпочтительно раствор в качестве интерферона содержит интерферон-альфа-2а или ПЭГ-интерферон-альфа-2а, в качестве неионогенного детергента - полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат, в качестве буфера - ацетат аммония или лактат натрия, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору - вещество, выбранное из группы: хлорид натрия, маннит, глицерин, аргинин, лизин, гистидин, метионин, этаноламин.

Далее, раствор предпочтительно содержит в качестве интерферона - интерферон-альфа-2а, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору - хлорид натрия при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
Интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-36)•10⁶
Полиоксиэтилен (20) сорбитан-моноолеат, мг - 0,2
Ацетат аммония или лактат натрия, мМ - 10
Бензиловый спирт, мг - 10
Хлорид натрия - В количестве, достаточном для придания изотоничности раствору
Предпочтительно также раствор содержит в качестве интерферона - ПЭГ- интерферон-альфа-2а, в качестве буфера - ацетат аммония, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору - хлорид натрия или маннит при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
ПЭГ-интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-36)•10⁶
Полиоксиэтилен (20) сорбитан-моноолеат, мг - 0,05
Ацетат аммония, мМ - 13
Бензиловый спирт, мг - 10
Хлорид натрия или маннит - В количестве, достаточном для придания изотоничности раствору
Предпочтительно указанный раствор имеет pH 4,9. Такие растворы обладают оптимальными потребительскими свойствами, т.е. стабильностью при хранении и биологической доступностью заявленного количества действующего ингредиента.

Для применения в настоящем изобретении может быть использован любой интерферон-альфа, например интерферон-альфа, как описано в Европейском патенте 43980 (ссылку в этом отношении как на зрелый человеческий лейкоцитарный интерферон-A, см. также в J. Pharm. Biomed. Analysis, т.7, N 2, 233-238, 1989).

Применяемый в настоящем изобретении интерферон-альфа может быть коньюгирован с полимером, таким как полиалкиленгликоль (замещенный или незамещенный), например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ), образуя ПЭГ-интерферон-альфа. Конъюгация может осуществляться с помощью различных сшивающих агентов, известных в данной области техники, в частности с помощью таких сшивающих агентов, которые описаны в публикациях европейских патентов EP-A-0510356 и A-0593868. Молекулярный вес полимера, предпочтительно полиэтиленгликоля, может находиться в диапазоне от 300 до 30000 Дальтон, и с интерфероном-альфа могут быть коньюгированы один или более, предпочтительно от одного до трех, полимеров. Предпочтительный конъюгат интерферона-альфа образуют с использованием интерферона-альфа-2а.

Предпочтительным интерфероном-альфа для применения по настоящему изобретению является интерферон-альфа-2а и ПЭГилированный (связанный с полиэтиленгликолем) интерферон-альфа-2а. Растворы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержат 10⁶-10⁸, в частности, (1-36)•10⁶ международных единиц (межд.ед.) интерферона-альфа на 1 мл.

Примерами неионогенных детергентов для применения в препаратах в соответствии с изобретением являются полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80 (полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат). Количество детергента в растворах в соответствии с изобретением составляет приблизительно 0,01-0,5 мг/мл, предпочтительно 0,05-0,2 мг/мл. Предпочтительными забуферивающими веществами являются ацетат аммония и лактат натрия. Пригодная концентрация этих забуферивающих веществ составляет 10-15 мМ. Растворы интерферона в соответствии с данным изобретением предпочтительно доводят до pH 5,0±0,1. В соответствии с настоящим изобретением бензиловый спирт включают в растворы в количестве приблизительно 8-20 мг/мл, предпочтительно 10 мг/мл. В качестве агентов, придающих изотоничность, рассматривают, в частности, хлорид натрия, маннит, глицерин и аминокислоты, прежде всего аргинин, лизин, гистидин и метионин, а также этаноламин. Предпочтительны хлорид натрия или маннит. Количество этих вспомогательных агентов, которые необходимы для достижения изотоничности, зависит от композиции раствора и может быть определено обычным специалистом в данной области техники.

Ниже изобретение проиллюстрировано с помощью примеров.

Пример 1. Получение ПЭГ-интерферона-альфа-2а.

ПЭГилирование. Интерферон-альфа-2а (ИФН) дважды подвергали диализу с помощью 10 л буфера, состоящего из 5 мМ ацетата натрия pH 5,0, содержащего 120 мМ NaCl. Один грамм материала (7,26 мг/мл) ПЭГилировали в молярном соотношении 3:1 с использованием твердого ПЭГ-реагента альфа-метил-омега- [2-[[(3-метил-2-пиридинилокси)карбонил] амино] этокси] поли(окси-1,2-этандиил) SRU 110. Значение pH раствора устанавливали путем добавления одной десятой объема 100 мМ бората натрия с pH 10,7. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре реакцию прекращали путем добавления 1 М глицина до окончательной концентрации глицина 20 мМ. Для достижения окончательного значения pH 5,0-6,0 добавляли одну двадцатую 1 М ацетата натрия с pH 4,0. Протеиновый раствор разбавляли четырехкратным буфером, содержащим 40 мМ ацетата аммония с pH 4,5.

Очистка. Разбавленную ПЭГилированную смесь загружали в 333-миллилитровую карбоксиметилцеллюлозную колонку, уравновешенную 40 мМ ацетатом аммония с pH 4,5, при скорости потока 19 мл/мин. ПЭГилированный интерферон элюировали с помощью 0-250 мМ градиента NaCl по отношению к 8 объемам колонки. Фракции, содержащие ПЭГ-ИФН, объединяли в пул на основании результатов электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Окончательный пул содержал 291 мг при концентрации 0,831 мг/мл. Объединенный в пул материал концентрировали до 3,96 мг/мл с помощью ультрафильтрационного устройства-камеры для перемешивания Amicon с использованием мембраны YM10 (порог мол.м. 10000).

Концентрированный материал (238 мг) загружали в 6,3-литровую гелевую фильтрационную колонку S-200, уравновешенную 40 мМ ацетатом аммония и 125 мМ NaCl. Скорость потока составляла 20 мл/мин. Фракции собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Пул, собранный с колонки S-200, содержал 480 мл при концентрации 0,48 мг/мл. Аликвотную часть пула колонки S-200 концентрировали до 8,7 мг/мл с использованием камеры для перемешивания Amicon. Этот материал использовали для получения композиций из примеров 4 и 5.

Пример 2. Раствор интерферона.

Ингредиент - Количество на мл
Интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-36)•10⁶
Ацетат аммония, мг - 0,77
Хлорид натрия, мг - 7,21
Бензиловый спирт, мг - 10,0
Полисорбат 80, мг - 0,2
Уксусная кислота до pH 5±0,1 - q.s.

NaOH 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Процедура получения. Композиции получали в асептических условиях на устройстве с ламинарным течением в 50-миллилитровых стерильных полипропиленовых пробирках с завинчивающимися колпачками. Эксципиенты растворяли в воде для инъекций, регулировали значение pH и растворы газировали азотом. Затем при осторожном перемешивании добавляли основной объем раствора интерферона, после чего при необходимости регулировали значение pH и доводили до конечного объема путем добавления воды для инъекций. Растворы фильтровали в стерильных условиях в чистой полипропиленовой пробирке с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм, слабо связывающего протеин, и заливали в 2-миллилитровые ампулы из стекла типа I. Ампулы продували азотом и закрывали пробками из синтетического бутилкаучука, покрытых инертной пленкой из фторполиэтилена.

Пример 3. Раствор интерферона.

Ингредиент - Количество на мл
Интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-36)•10⁶
Ацетат аммония, мг - 0,77
Глицерин, мг - 20,0
Бензиловый спирт, мг - 10,0
Полисорбат 80, мг - 0,2
Уксусная кислота до pH 5,0±0,1 - q.s.

NaOH 0,1 H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Процедура получения: аналогично примеру 2.

Пример 4. Раствор интерферона
Ингредиент - Количество на мл
ПЭГ-интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-18)•10⁶
Ацетат аммония, мг - 1,0
Хлорид натрия, мг - 5,0
Бензиловый спирт, мг - 10,0
Полисорбат 80, мг - 0,05
Уксусная кислота до pH 5,0±0,1 - q.s.

NaOH 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Процедура получения: аналогично примеру 2.

Пример 5. Раствор интерферона
Ингредиент - Количество на мл
ПЭГ-интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1-18)•10⁶
Ацетат аммония, мг - 1,0
Хлорид натрия, мг - 3,0
Маннит, мг - 30,0
Бензиловый спирт, мг - 10,0
Полисорбат 80, мг - 0,05
Уксусная кислота до pH 5,0±0,1 - q.s.

NaOH 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Процедура получения: аналогично примеру 2.

Для проведения сравнения растворы интерферона-альфа-2а из примера 2, содержащие 3•10⁶ межд. ед. ИФН-альфа-2а (A/З), 6•10⁶ межд.ед. ИФН-альфа-2а (A/6), 9•10⁶ межд. ед. ИФН-альфа-2а (A/9), 18•10⁶ межд.ед. ИФН-альфа-2а (A/18) и 36•10⁶ межд.ед. ИФН-альфа-2а (A/36) и соответствующие растворы без бензилового спирта (B/3-36) готовили в соответствии с процедурой получения, приведенной в примере 2, и хранили в темноте при 5,25 и 35^oC. Содержание интерферона-альфа-2а в ампулах определяли после трехмесячного хранения. Образцы фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и анализировали с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой для определения сохранившегося основного компонента интерферона-альфа-2а. Метод ЖХВР имеет стандартное отклонение приблизительно 5%. Результаты опытов по исследованию хранения приведены в табл. 1.

Лучшая стабильность при хранении раствора A очевидна, прежде всего при повышенной температуре хранения.

Аналогичным образом получали раствор ПЭГилированного ИФН из примера 4, содержащий 3•10⁶ межд.ед. ПЭГилированного интерферона-альфа-2а (C/3) и соответствующий раствор без бензилового спирта (D/3) и хранили в течение 24 мес. при 5 и 25^oC. Результаты опытов по исследованию хранения приведены в табл. 2.

Эти опыты также подтверждают лучшую стабильность при хранении растворов, полученных с добавлением бензилового спирта.

Пример 6. Как указывалось выше, растворы интерферона без HSA известны из международной заявки WO 89/04177 и японского патента 61-277633, EP 440100. Стабильность растворов, полученных в соответствии с изобретением, сравнивали со стабильностью растворов интерферона-альфа-2а, полученных по аналогии с этими известными растворами. Готовили растворы следующего состава:
Раствор X
Интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (3-36)•10⁶
Ацетат аммония, мг - 0,77
Хлорид натрия, мг - 8,77
Полисорбат 80, мг - 0,3
Уксусная кислота до pH 5,0±0,1 - q.s.

NaOH 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Раствор Y
Интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (3-36)•10⁶
Янтарная кислота, мг - 0,27
Двунатриевая соль янтарной кислоты, мг - 0,73
D-маннит, мг - 40,0
Полисорбат 80, мг - 0,1
HCl 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

NaOH 0,1H до pH 5,0±0,1 - q.s.

Вода для инъекций, мл - До 1,0
Растворы X и Y соответствуют растворам, описанным в вышеуказанных документах, однако вместо интерферона-бета или интерферона-гамма использовали 3, 6, 9, 18 и 36•10⁶ межд.ед. интерферона-альфа-2а. В нижеприведенной табл. 3 представлены результаты, полученные после 3 мес. хранения при различных температурах.

Из данных табл. 3 видно, что при применении технологии, описанной в вышеуказанных документах, не может быть достигнута приемлемая стабильность при хранении интерферона-альфа-2а.

Изобретение относится к медицине. Раствор содержит интерферон-альфа, буфер, pH 4,5 - 5,5, неионогенный детерпент, бензиловый спирт, воду и, необязательно, агент, придающий изотоничность. Предложенный состав является стабильным. 5 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Водный раствор интерферона, содержащий интерферон-альфа, буфер, бензиловый спирт, отличающийся тем, что он дополнительно содержит неионогенный детергент и буфер для установления pH 4,5 - 5,5 при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
Интерферон-альфа, межд. ед. - 10⁶ - 10⁸
Неионогенный детергент, мг - 0,01 - 0,5
Буфер для установления pH 4,5 - 5,5, ммоль - 10 - 15
Бензиловый спирт, мг - 8 - 20
2. Раствор по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит вещество, придающее изотомичность раствору. 3. Раствор по п.2, отличающийся тем, что в качестве интерферона он содержит интерферон-альфа-2а или ПЭГ-интерферон-альфа-2а, а в качестве неионогенного детергента - полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат, в качестве буфера - ацетат аммония или лактат натрия, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору - вещество, выбранное из группы хлорид натрия, маннит, глицерин, аргинин, лизин, гистидин, метионин, этаноламин. 4. Раствор по п.2, отличающийся тем, что в качестве интерферона он содержит интерферон-альфа-2а, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору, - хлорид натрия при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
Интерферон-альфа-2а, межд. ед. - (1 - 36) • 10⁶
Полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат, мг - 0,2
Ацетат аммония или лактат натрия, ммоль - 10
Бензиловый спирт, мг - 10
Хлорид натрия - В количестве достаточном для придания изотоничности раствору
5. Раствор по п.2, отличающийся тем, что в качестве интерферона он содержит ПЭГ-интерферон-альфа-2а, в качестве буфера-ацетат аммония, а в качестве вещества, придающего изотоничность раствору, - хлорид натрия или маннит при следующем соотношении компонентов на 1 мл:
ПЭГ-интерферон-альфа-2а, межд.ед. - (1 - 36) • 10⁶
Полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат, мг - 0,05
Ацетат аммония, ммоль - 13
Бензиловый спирт, мг - 10
Хлорид натрия или маннит - В количестве, достаточном для придания изотоничности раствору
6. Раствор по пп.1 - 5, отличающийся тем, что имеет pH 4,9 - 5,1.