СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА Российский патент 1998 года по МПК A61K31/68 A61K31/375 

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к подавлению роста злокачественных опухолей.

Широко известен способ подавления опухолевого роста с применением цитостатических средств, таких как, например, цисдихлордиаминоплатина (ДДП), фарморубицин, таксол [2].

Этот способ используется для лечения солидных опухолей различной локализации, но применяющиеся в нем цитостатики в терапевтически эффективных дозах и режимах обладают высокой токсичностью, проявляющейся в отношении жизненно важных органов [2].

Задачей настоящего изобретения является изыскание способа, который бы обеспечил повышение терапевтической эффективности при уменьшении токсичности.

Для решения этой задачи предложен способ подавления опухолевого роста, включающий применение цитостатических средств и смеси октакарбоксифталоцианина кобальта (ОКФК) или оксикобаламина с аскорбинатом натрия (AKNa) при молярном соотношении 1:20 - 40.

При увеличении указанного соотношения резко возрастает токсичность, а при уменьшении-снижается эффективность.

Хотя известно, что комплекс кобальта с замещенными фталоцианинами или производные коррина с аскорбиновой кислотой могут применяться для предотвращения опухолевого роста [1], однако нельзя было заранее предсказать эффективность способа с применением известных цитостатических средств в сочетании с вышеупомянутыми препаратами.

Неожиданно было обнаружено, что предлагаемый способ обеспечивает повышение терапевтической эффективности при уменьшении токсичности.

Цитотоксическую активность препаратов, применяемых в предложенном способе, определяли в соответствии с методикой 1.

Методика 1.

Определение цитотоксической активности препаратов проводят с использованием биотеста, основанного на ингибировании пролиферации перевивной культуры клеток аденокарциномы легкого человека А-549, обусловленном воздействием цитотоксических агентов.

Для культивирования клеток линии А-549 используют среду Игла с добавлением 100 мкг/мл гентамицина и 10%-ного раствора эмбриональной телячьей сыворотки, предварительно инактивированной нагреванием. Культивирование клеток проводят в стандартных условиях: при 37^oC в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода.

При постановке цитотоксического биотеста в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета ("Sarstedt", США) вносят по 100 мкл суспензии клеток линии А-549 в концентрации 1,0 • 10⁵ клеток/мл и к началу фазы логарифмического роста добавляют тестируемые препараты в объеме 100 мкл/лунку.

Цитотоксическую активность тестируемых препаратов оценивают колориметрическим методом, основанным на способности митохондриальных дегидрогеназ живых тест-клеток восстанавливать экзогенно вносимый растворимый бромид 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия (МТТ, "Sigma Chemical Co, США) в нерастворимый кристаллический формазан. При этом в каждую лунку 96-луночного микропланшета вносят по 20 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл, после чего центрифугируют клеточные культуры, удаляют из лунок весь объем культуральной среды. Для солюбилизации окрашенных продуктов реакции (кристаллов формазана) в каждую лунку микропланшета вносят по 150 мкл диметилсульфоксида ("Sigma") и инкубируют микропланшеты при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. Результаты учитывают по поглощению при длине волны 550 нм на миниридере "Dynatech" (ФРГ).

Уровни ингибирования пролиферации клеточных культур препаратами, тестируемыми на цитотоксическую активность, вычисляют по формуле
,
где
ИП - уровень ингибирования пролиферации;
П₀ - уровень пролиферации в опыте (с препаратами): поглощение красителя в опытных образцах:
П_к - уровень пролиферации в контроле (без препаратов): поглощение красителя в контрольных образцах.

Определяют также:
ИК₅₀ - (интегральный показатель цитотоксической активности) - концентрация цитотоксического агента, при которой наблюдается ингибирование пролиферации культуры клеток на 50%.

ТВ (терапевтический выигрыш) - выраженное в процентах изменения ИК₅₀ цитостатика в присутствии каталитической пары относительно ИК₅₀ индивидуального цитостатика.

Испытание предложенного способа "in vivo" проводили в соответствии с методикой 2.

Методика 2.

Для испытания использовали мышей линии СВА, самцов с асцитной опухолью Эрлиха (АОЭ).

АОЭ прививали внутрибрюшинно (в/б) в количестве 0,1 мл асцитной жидкости, взятой на 7-й день роста опухоли. День перевивки считали нулевым днем роста опухоли. Лечение начинали через 24 ч после перевивки опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению продолжительности жизни животных (УПЖ), вычисленному по формуле:
УПЖ = [(СПЖ_опыт - СПЖ_контр.)/СПЖ_контр.] • 100%
где
СПЖ_опыт. - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе,
СПЖ_контр. - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе.

Биологически значимым эффектом считали УПЖ > 25% при условии достоверно отличающихся СПЖ.

Испытание цитотоксических свойств препаратов, предлагаемых для настоящего способа.

Пример 1 - 3. Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1: 20, 1: 30, 1:40 и ДДП в виде аптечного препарата ("Платидиам", ДДП, Чехия) в концентрации 5 мкг/мл и проводят испытания в соответствии с методикой 1. Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК - AKNa на ДДП приведена в таблице 1, а также на фиг. 1.

Примеры 4 - 6.

Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1:20, 1: 30, 1:40 и фарморубицин (концентрация 0,15 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 2 и на фиг. 2.

Примеры 7 - 8. Берут ОКФК (концентрация 35 мкг/мл) и ARNa в молярном соотношении 1:20, 1:30, 1:40 и таксол (концентрация 0,01 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 3 и на фиг. 3.

Примеры 10 - 12. Берут оксикобаламин (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1: 20, 1: 30, 1:40 и фарморубицин (концентрация 0,1 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции ОКФК и AKNa приведена в таблице 4 и на фиг. 4.

Примеры 13 - 15. Берут оксикобаламин (концентрация 35 мкг/мл) и AKNa в молярном соотношении 1:20, 1:30, 1:40 и таксол (концентрация 0,01 мкг/мл) и проводят испытания в соответствии с методикой 1.

Характеристика модифицирующего эффекта композиции оксикобаламина и AKNa приведена в таблице 5 и на фиг. 5.

Испытание способа в соответствии с изобретением "in vivo"
Испытания проводили в соответствии с методикой 2. Для испытания использовали аптечный препарат ДДП, опытно-промышленный препарат ОКФК и аптечный препарат аскорбиновой кислоты, нейтрализованный ex tempore (т.е. AKNa), который вводили в/б в молярном соотношении ОКФК:AKNa = 1:20, 1:30, 1:40.

Контрольные животные получали:
1-я группа - 0,9% раствор NaCl;
2-я группа - ДДП (4 мг/кг);
3-я группа - ОКФК (50 мг/кг);
4-я группа - AKNa (160 мг/кг);
5-я группа - AKNa (240 мг/кг);
6-я группа - AKNa (320 мг/кг);
7-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:20;
8-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:3;
9-я группа - ОКФК:AKNa в молярном соотношении 1:40.

Опытные животные получили:
10-я группа ДДП (4мг/кг _→ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (160 мг/кг)]
11-я группа ДДП (4 мг/кг) _→ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (240 мг/кг)]
12-я группа ДДП (4 мг/кг) _→ [ОКФК (50 мг/кг) + AKNa (320 мг/кг)]
Противоопухолевый эффект оценивали в соответствии с методикой 2. Результаты испытаний в таблице 6 и на фиг. 6.

Таким образом, как видно из таблиц 1-6 и фиг. 1-6, предлагаемый способ обеспечивает эффективное подавление опухолевого роста при снижении токсичности, обусловленном применением известных токсичных цитостатических средств в минимальных дозах: ИК₅₀ для ДДП, таксола и фарморубицина при традиционном применении составляет соответственно 6,4; 9,5 и 0,27 мкг/мл, а при их применении по предлагаемому способу может быть снижено до 2,2; 0,0045 и 0,07 мкг/мл.

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к способам подавления роста злокачественных опухолей. Для этого используют известные цитостатические средства в сочетании со смесью, состоящей из октакарбоксифталоцианина кобальта или оксикобаламина и аскорбината натрия, при молярном соотношении компонентов 1 : 20 - 40. Способ обладает высокой эффективностью при уменьшении токсичности. 6 табл., 6 ил.

Способ подавления опухолевого роста с применением цитостатических средств, отличающийся тем, что дополнительно применяют смесь октакарбоксифталоцианина кобальта или оксикобаламина с аскорбинатом натрия при молярном соотношении 1 : 20 - 40.