СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА Российский патент 2013 года по МПК A61K31/375 A61K31/40 A61K31/4196 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, более конкретно к онкологии, а именно к подавлению роста злокачественных опухолей.

В настоящее время по данным ВОЗ рак является одной из основных причин смерти в большинстве районов мира, включая и развитые страны, где он стоит на втором месте после сердечно-сосудистых заболеваний и составляет 15-20% от общего ежегодного числа смертельных случаев. Химиотерапия является одним из важнейших методов лечения, в арсенал которой входит более 40 фармакологических препаратов, обладающих цитотоксическими свойствами и направленных на подавление роста опухолевых клеток.

Широко известны способы с применением цитостатиков разного механизма действия, например цис-дихлордиаминоплатины и других платиновых комплексов. Обладая широким спектром действия, эти лекарственные средства используется для лечения солидных опухолей различной локализации [Cancer Treat Rep. 1982 Jan; 66(1): 135-46; Вопросы онкологии, 1989, 35,3, с.325-330]. Основным недостатком цитостатиков является недостаточная избирательность противоопухолевого действия, что проявляется как побочное действие на клетки желудочно-кишечного тракта, кроветворение, нефротоксичность [Вопросы онкологии, 1975, 21, 8, с.95-105].

В настоящее время получила распространение фотодинамическая терапия опухолей, в которой используются фотосенсибилизаторы - свободные тетрапиррольные макроциклические лиганды или их комплексы с металлами, например алюминиевый комплекс сульфированного фталоцианина Al[Рс(SO₃H)_2-3]. Применение этого способа возможно только в случае опухолей поверхностной локализации, точнее - доступных для лазерного световода [Итоги науки и техники. М.; ВИНИТИ, 1990, 3, с.5-6].

Наиболее близок к предлагаемому изобретению способ с применением бинарной каталитической системы (БКС), содержащей октакарбоксифталоцианин кобальта (терафтал, ТФ) и биогенный восстановитель (аскорбиновую кислоту, АК), в соотношении концентраций компонентов 1:10. Применение этого способа позволяет подавить пролиферацию опухолевых клеток in vitro и тормозить рост широкого круга перевиваемых опухолей у мышей: солидных опухолей (меланомы В 16, аденокарциномы молочной железы Са-755) и асцитных опухолей (карциномы Эрлиха, асцитной гепатомы 22), [Рос. хим. журнал. - 1998. - Т.XLII, №5. - с.140-146..].

В ходе клинических испытаний установлена способность каталитической системы «терафтал+аскорбиновая кислота» вызывать стабилизацию процесса у больных с исчерпанными возможностями специфической терапии при таких резистентных к воздействию цитостатиков злокачественных опухолях как рак почки, рак коры надпочечников, злокачественный карциноид и ряде других. Положительный лечебный эффект (стабилизация процесса, минимальная регрессия опухоли) отмечены у 25 больных из 95 (26,3%). [РБЖ. - 2005. - №1, т.4. - с.105-107].

Эти данные свидетельствуют о недостаточном лечебном эффекте БКС, что заставляет искать дополнительные способы повышения ее эффективности.

Задачей изобретения является изыскание более эффективного способа с применением указанной БКС для подавления опухолевого роста.

Для решения поставленной задачи предлагается использовать способ подавления роста опухоли с использованием бинарной каталитической системы терафтал и аскорбиновая кислота, причем до введения БКС внутривенно вводят 3-амино-1,2,4 триазол (3-АТ) в нетоксической дозе.

Испытания заявляемого способа подавления опухолевого роста на цитотоксическую и противоопухолевую активность были проведены на культурах опухолевых клеток (in vitro) и на мышах с перевиваемыми опухолями (in vivo).

Определение активности препаратов на культурах опухолевых клеток (in vitro).

Методика 1. Определение цитостатической активности комбинации БКС (ТФ+АК) в условиях преинкубации с 3-АТ проводили с использованием биотеста, основанного на ингибировании пролиферации лейкозных клеток человека 2-х линий (линия U937 и К562), обусловленного воздействием цитотоксических агентов.

Для культивирования лейкозных клеток использовали среду RPMI 1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина и 20 мкМ глютамина. Культивирование клеток проводили в стандартных условиях: при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода.

При постановке цитостатического биотеста в лунки плоскодонного 96-ти луночного микропланшета ("Costar", США) вносили по 200 мкл суспензии клеток (концентрация) 2·10⁴ клеток/лунку/200 мкл с добавлением к началу фазы логарифмического роста тестируемых препаратов в объеме 20 мкл/лунку.

Цитостатическую активность тестируемых препаратов оценивали колориметрическим методом, основанным на способности митохондриальных дегидрогеназ живых тест-клеток восстанавливать экзогенно вносимый растворимый бромид 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия (МТТ, "Sigma Chemical Co", США) в нерастворимый кристаллический формазан. При этом в каждую лунку 96-ти луночного микропланшета вносили по 20 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл, после чего центрифугировали клеточные культуры, удаляли из лунок весь объем культуральной среды. Для солюбилизации окрашенных продуктов реакции (кристаллов формазана) в каждую лунку микропланшета вносили по 60 мкл диметилсульфоксида ("Sigma") и инкубировали микропланшеты при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. Результаты учитывали по поглощению при длине волны 530 нм на миниридере «Uniplan» (Россия)

Уровни ингибирования пролиферации клеточных культур препаратами, тестируемыми на цитостатическую активность, вычисляли по формуле

$$И{П}_{\left(\%\right)}=100\%-\frac{{П}_{о}}{{П}_{к}}\times 100\%$$

где ИП - уровень ингибирования пролиферации,

П_о - уровень пролиферации в опыте (с препаратами); поглощение красителя в опытных образцах;

П_к - уровень пролиферации в контроле (без препаратов); поглощение красителя в опытных образцах.

Количественным критерием эффективности препаратов in vitro служит показатель IC50, соответствующий концентрации препаратов, при которой достигается 50% выживаемость клеток.

Статистическую обработку результатов проводили методом проб анализа.

В табл.1 представлены данные, полученные при исследовании ингибирования пролиферации in vitro опухолевых клеток в присутствии комбинации ТФ+АК с 3-АТ.

Таблица 1 Ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro в присутствии комбинации ТФ+АК после преинкубации с 3-АТ в течение 1 часа Линии клеток IC50 БКС, мкМ БКС БКС+(3-АТ) U937 33±0.7 15±1.3 К562 25±0.5 12±08

Методика №2.

Определение влияния 3-АТ на противоопухолевый эффект БКС (ТФ+АК) выполнялось на мышах с перевиваемыми опухолями (in vivo).

Испытания были проведены на подкожно трансплантированной меланоме В16 (пример). Лекарственную форму терафтал-ЛИО растворяли в стерильном физиологическом растворе до получения 0,2% концентрации. 5% аптечный раствор аскорбата натрия растворяли в стерильной дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида до концентрации 2,2%. Субстанцию 3-АТ сухой рассыпки во флаконах (Sigma) растворяли в стерильном физиологическом растворе до получения 5% концентрации. Путь введения - внутривенный.

Торможение роста опухоли (солидной) рассчитывали по формуле:

$$TPO=\frac{V_{ср.контроля}-V_{ср.опыта}}{V_{ср.контроля}}\times 100\%$$

где V_cp - средний объем опухоли (контроль и опыт), рассчитанный как произведение трех измерений и выраженный в мм³.

Результаты, полученные на мышах с опухолями, оценивают с помощью общепринятых показателей противоопухолевой активности при наличии в качестве контроля мышей, не получавших противоопухолевой терапии [Трещалина Е.М., и др. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общей ред. Член-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО изд. «Медицина», 2005 г. стр.637-651]..

Пример. Опухоль, меланому В 16, прививали мышам подкожно (п/к). Прививочная доза 50 мг взвеси опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199 на мышь. Использованы мыши-самки. Вес мыши - не менее 18 г. Начало лечения - через 72 ч после прививки опухоли.

У мышей контрольной группы без лечения на 8, 11 и 14 сутки после трансплантации средний объем опухоли составлял 470±146 мм³, 2735±640 мм³ и 5308±1332 мм³.

В группе мышей, получивших лечение ТФ в разовой дозе 40 мг/кг и через 1 час АК в разовой дозе 88 мг/кг на 5, 8 и 11 сутки после лечения средний объем опухоли составлял 223±141 мм³, 2097±813 мм³ и 4992±2003 мм³, соответственно.

По отношению к группе контроля в группе ТФ+АК торможение роста опухоли не достигло достоверных отличий и составило, соответственно 53%, 23% и 6%. Гибели от токсичности не наблюдали.

В группе мышей, получивших предварительно за 2 часа до начала применения БКС 3-АТ в дозе 1000 мг/кг, на 5, 8 и 11 сутки после лечения средний объем опухоли составлял, соответственно 147±78 мм³, 1323±661 мм³ и 3347±1207 мм³.

По отношению к группе контроля в группе 3-АТ+ТФ+АК торможение роста опухоли достигло достоверного отличия на 5 сутки после лечения и составило 69%, оставаясь в течение 11 суток на значимом уровне 52 и 37%.

По отношению к группе ТФ+АК торможение роста опухоли было увеличено в 1,3-2,4-6,0 раз соответственно срокам регистрации эффекта.

Гибели от токсичности не наблюдали.

Таблица 2 Динамика роста п/к меланомы В16 и эффективность воздействия при сочетании 3-АТ и ТФ+АК Группа Доза Средний объем опухоли (мм³) с доверительным интервалом ТРО% на сутки после лечения 8 11 14 5 8 11 Контроль роста опухоли (физ.р-р) 0,2 мл/мышь 470 [324÷616] 2735 [2095÷3375] 5308 [3976÷6640] - - - ТФ+АК 40+88 мг/кг 223 [82÷364] 2097 [1284÷2910] 4992 [2989÷6995] 53 23 6 3-АТ+2ч+[ТФ+АК] 1000+[40+88] мг/кг 147 [69÷225] 1323 [662÷1984] 3347 [2140÷4554] 69* 52 37 Примечание: *отличие от контроля достоверно, р<0,05.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет усилить эффективность подавления роста относительно малочувствительного к действию каталитической системы ТФ+АК злокачественного новообразования, а именно: добиться подавления пролиферации раковых клеток (in vitro) и увеличения торможения роста опухолей у мышей в 1,3-6,0 раз по сравнению с прототипом в зависимости от сроков регистрации эффекта.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для подавления опухолевого роста. Для этого применяют бинарную каталитическую систему, содержащую натриевую соль октакарбоксифталоцианина кобальта и аскорбиновую кислоту. При этом до введения бинарной каталитической системы внутривенно вводят 3-амино-1,2,4-триазол в нетоксической дозе. Изобретение обеспечивает подавление роста злокачественных новообразований, малочувствительных к действию бинарной каталитической системы. 2 табл., 2 пр.

Способ подавления опухолевого роста с применением бинарной каталитической системы, содержащей натриевую соль октакарбоксифталоцианина кобальта и аскорбиновую кислоту, отличающийся тем, что до введения бинарной каталитической системы внутривенно вводят 3-амино-1,2,4-триазол в нетоксической дозе.