СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 C07D311/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа выделения дигидрокверцетина (3,3',4', 5,7-пентагидроксифлаванона)(ДКВ).

Природным источником ДКВ служит древесина лиственницы. Все известные способы получения его из древесины лиственницы позволяют достичь степени чистоты ДКВ от 90 до 97%. При этом примесями являются, как правило, родственные по структуре другие флавоноидные соединения. Освобождение от этих примесей затруднено тем, что эти соединения имеют близкие с ДКВ физико-химические свойства (растворимость, сорбционная способность и др.).

Известен ряд способов получения ДКВ со степенью чистоты, не превышающей 97%. Из измельченной древесины лиственницы путем экстрагирования органическим растворителем непосредственно после обработки сырья водой, упаривания экстракта и кристаллизации из горячей воды (Патент РФ N 2038094, А 61 К 35/78, 1995).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ выделения ДКВ путем экстракции опилок древесины лиственницы водой при нагревании, охлаждении, фильтровании и очистки на полиамидном сорбенте, элюировании целевого продукта этилацетатом и кристаллизации из горячей воды. Степень очистки ДКВ составляет 97% (Патент РФ N 2000797, А 61 К 35/78, 1993).

Основным недостатком прототипа является недостаточно высокая степень очистки: содержание ДКВ не более 97% и наличие примесных флавоноидных соединений.

Целью изобретения является выделение ДКВ со степенью чистоты не менее 99,5%, т. е. получение препарата высочайшей степени очистки, который может применяться в качестве стандартного образца при промышленном получении ДКВ, а также для стандартизации отечественного фитопрепарата "Диквертин" (ВФС 42-2397-96) и его разнообразных лекарственных форм. Стандартный образец ДКВ может широко использоваться для исследования состава и в целях стандартизации многих лекарственных флавоноидсодержащих препаратов растительного происхождения, а также в ряде областей биотехнологии.

Это достигается путем предварительной обработки сырья кипящей водой, последующей экстракции водным раствором ацетона и очистки высушенного водно-ацетонового экстракта препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенно-фазных сорбентах типа Сферисорб С2-С18 с размером частиц 5-10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы 30-50%-ного раствора ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты и удалении ацетона упариванием.

Предлагаемому способу выделения ДКВ присущи следующие достоинства: высочайшая степень очистки ДКВ, более 99,5%; мягкие условия разделения, не вызывающие превращение ДКВ в другие продукты и соответственно предотвращающие загрязнение конечного продукта; инертность обращенно-фазного сорбента, разделение на котором не приводит к образованию продуктов взаимодействия с сорбентом, загрязняющих конечный продукт.

Пример 1. К 100 г опилок древесины лиственницы (влажность 35%, содержание дигидрокверцетина 2,35 г, дигидрокемпферола 0,28 г, нарингенина 0,087 г), приливают 75 мл кипящей воды, перемешивают в течение 5 мин, приливают 390 мл ацетона, выдерживают в течение 20 мин при 40^oС. Водно-ацетоновый экстракт отфильтровывают, опилки промывают 20 мл ацетона, ацетоновый слив объединяют с экстрактом и досуха упаривают на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 40 мл ацетона.

Полученный раствор хроматографируют на жидкостном хроматографе Хром-5 с рефрактометрическим детектором. Колонка Сферисорб 5 С18, 20 х 250 мм. Подвижная фаза: 40%-ный раствор ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты. Скорость потока 7,5 мл/мин, объем вводимой пробы 1 мл.

1 мл ацетонового раствора, содержащего 50 мг ДКВ, вводят в хроматограф. После начала выхода пика ДКВ отбирают фракцию 40 мл. По завершении каждого хроматографического цикла колонку промывают ацетоном. Перед началом следующего цикла колонку уравновешивают 80 мл подвижной фазы.

Отобранную фракцию упаривают на роторном испарителе при 30^oС до полного удаления ацетона. Полученную кристаллическую массу отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, высушивают в вакууме при комнатной температуре над молекулярными ситами 4 ангстрема. Выход ДКВ составил 38 мг, т.е. 76% от введенного в хроматограф количества.

По данным аналитического метода ВЭЖХ степень чистоты полученного ДКВ составляет 99,75% (см. чертеж).

Пример 2. 1 мл ацетонового раствора (содержание ДКВ 50 мг), полученного в условиях примера 1, вводят в хроматограф Хром-5 с рефрактометрическим детектором. Колонка Сферисорб 5 С8, 20 х 250 мм. Подвижная фаза: 30%-ный раствор ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты.

После начала выхода пика ДКВ отбирают фракцию 40 мл, упаривают на роторном испарителе до полного удаления ацетона. После фильтрования, промывки дистиллированной водой выпавших кристаллов и высушивания получают 36 мг ДКВ, т. е. 72,0% от введенного в хроматограф количества. По данным аналитического метода ВЭЖХ степень чистоты полученного ДКВ составляет 99,5%.

Пример 3. 1 мл ацетонового раствора (содержание ДКВ 50 мг), полученного в условиях примера 2, вводят в хроматограф Хром-5 с рефрактометрическим детектором. Колонка Сферисорб 5 С2, 20 х 250 мм. Подвижная фаза: 50%-ный раствор ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты.

После начала выхода пика ДКВ отбирают фракцию 40 мл, упаривают на роторном испарителе до полного удаления ацетона. После фильтрования, промывки дистиллированной водой выпавших кристаллов и высушивания получают 37 мг ДКВ, т. е. 74,0% от введенного в хроматограф количества. По данным аналитического метода ВЭЖХ степень чистоты полученного ДКВ составляет 99,55%.

Пример 4. 1 мл ацетонового раствора (содержание ДКВ 50 мг), полученного в условиях примера 1, вводят в хроматограф Хром-5 с рефрактометрическим детектором. Колонка Сферисорб 10 С18, 20 х 250 мм. Подвижная фаза: 40%-ный раствор ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты.

После начала выхода пика ДКВ отбирают фракцию 40 мл, упаривают на роторном испарителе до полного удаления ацетона. После фильтрования, промывки дистиллированной водой выпавших кристаллов и высушивания получают 37,5 мг ДКВ, т. е. 75,0% от введенного в хроматограф количества. По данным аналитического метода ВЭЖХ степень чистоты полученного ДКВ составляет 99,6%.

Таким образом, предлагаемый способ выделения ДКВ позволяет получать конечный продукт высочайшей степени очистки.

Количественный анализ содержания ДКВ в конечном продукте проводился методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора. Колонка 250 х 4,6 мм, сорбент Lichrosorb 10 RP-2, подвижная фаза ацетонитрил-2%-ная уксусная кислота (3:7). Аналитическая длина волны 290 нм. Относительная ошибка единичного определения при уровне значимости 95% не превышала 3%.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается способа выделения дигидрокверцетина. Изобретение решает задачу получения продук-та со степенью чистоты не менее 99,5%. Способ осуществляется посредством предварительной обработки древесины лиственницы кипящей водой с последующей экстракцией водным раствором ацетона и очистки водно-ацетонового экстракта жидкостной хромато-графией на обращенно-фазных сорбентах типа сферисорб C2 - C18 с размером частиц 5 - 10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы 30 - 50%-ного раствора ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты и удалении ацетона упариванием. Технический результат заключается в получении дигидрокверцетина высочайшей степени очистки, более 99,5%. 1 ил.

Способ выделения дигидрокверцетина путем экстракции древесины лиственницы при нагревании, охлаждения, фильтрования, очистки отфильтрованного экстракта хроматографией и упаривания элюата, отличающийся тем, что пред экстракцией сырье обрабатывают кипящей водой, экстракцию проводят водным раствором ацетона, водно-ацетоновый экстракт высушивают и очищают его высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенно-фазных сорбентах типа Сферисорб С2-С18 с размером частиц 5-10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы 30-50%-ного ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты.