ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИСТРЕССОРНЫМ, ПРОТИВОСУДОРОЖНЫМ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1998 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно - пептидам общей формулы: Trp-X-Gly-Gly-Asp-R, где X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации, R-Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или Ala; а также их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием. Предлагаемые соединения могут найти применение в медицине.

В процессе жизнедеятельности организм человека подвергается воздействию различных по силе и характеру раздражителей, что приводит к развитию стресс-реакций, которые, по определению Селье, представляют собой совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых воздействий (Горизонтов П.Д. Общая характеристика и значение реакции стресса. -Вестник АМН СССР, 1975, N 8, с.30-35; Селье Г. Стресс без дистресса. -М.: Прогресс, 1982. - 128 с.

В ответе на значительные воздействия неблагоприятных факторов внешней среды в организме человека и животных происходят адаптивные биохимические и физиологические изменения, которые, однако, в случае чрезмерных и продолжительных нагрузок приобретают патологический характер и вызывают или обостряют многие серьезные заболевания. В связи с этим проблема адаптации человека к критическим факторам внешней среды и повышение его устойчивости к их возмущающему воздействию является исключительно актуальной.

В настоящее время известны эндогенные нейропептиды (вещество P, опидные пептиды), обладающие адаптогенным и антистрессорным действием (Нейрохимия. Под ред. Ашмарина И. П. и Стукалова П.В..- М.: Изд-во института биомедицинской химии РА МН, 1996, с. 207-310).

Но спектр действия этих пептидов достаточно широк, и наряду с антистрессорным они проявляют побочные нежелательные эффекты.

Известен пептид дельта-сна (DSIP), который обладает выраженной способностью нормализовать или ограничивать вызванные стрессом биохимические сдвиги в организме и не обладает при этом побочными эффектами (Khvatova E.M., Rubanova N. A. , Prudchenko I.A., Mikhaleva I.I. (1995), Effects of delta-sleep inducing peptide (DSIP) and some analogues on the activity of monoamine oxidase type A in rat brain under hypoxia stress. FEBS Letters, 368, pp 367 - 369; Менджерицкий А.М., Лысенко А.В., Ускова Н. И. -Биохимия, 1995, т. 60, вып.4, с. 585-592; Менджерицкий А.М., Лысенко А.В., Михалева И.И. Влияние ДСИП на интенсивность протеолитических процессов в мозге крыс при гипокинезии. -Укр. биохим.журн., 1992, 64, с. 47-51. Рихерева Г.Т, Маклецова М. Г. и др. Изменение интенсивности свободнорадикальных реакций в органах крыс при гипокинетическом стрессе и защите дельта-сон индуцирующим пептидом и его тирозинсодержащим аналогом. - Известия РАН, 1993, N 2, с. 243-256).

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям.

Предлагаемые пептиды общей формулы:
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
где
X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации,
R-Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, Ala,
являются аналогами пептида дельта-сна (DSIP), содержащими 6-9 аминокислотных остатков (табл. 1) и обладают антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием.

В отличие от природного пептида DSIP предлагаемые пептиды обладают селективным и значительно более выраженным действием. Эти пептиды получают с помощью твердофазного или классического синтеза в растворе и затем очищают и выделяют в гомогенном состоянии.

Пример 1. Получение исследуемых соединений.

Синтез пептидов осуществляют методом последовательного наращивания пептидной цепи с использованием трет-бутилоксикарбонильной схемы твердофазного пептидного синтеза. Синтез проводят в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе. Для временной защиты α -аминогруппы аминокислот используют трет-бутилоксикарбонильную группировку. Для защиты боковых функциональных групп аминокислот используют бензиловые эфиры для Glu и Ser, циклогексиловый эфир для Asp. Остаток DTyr вводят без защиты боковой функции. В качестве носителя используют аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с 4-гидроксиметилфенилацетамидо-метильной (РАМ) якорной группировкой. Для проведения реакции конденсации используют 3-кратные избытки реагентов: Вос-аминокислоты, диизопропилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола. Полноту протекания реакции контролируют с помощью качественного и количественного нингидринового теста. Конечное деблокирование пептидов осуществляют жидким фтористым водородом в присутствии n-крезола и индола (9:0,8:0,2) при 0^oC в течение 1 ч. После удаления из реакционной смеси фтористого водорода остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (5х15 мл) на стеклянном фильтре и затем экстрагируют пептид 15% уксусной кислотой (3х10 мл) и лиофилизуют. Для очистки пептидов используют гель-хроматографию на Сефадексе G-15 в 0,1 М уксусной кислоте. Для подтверждения чистоты полученных соединений проводят ВЭЖХ на приборе System Gold (BecKman, США) с использованием колонки Nucleosil 5C18 (4 х 200 мм) фирмы "Macherey-Nagel"(ФРГ). Условия хроматографии: система A - 0,2 % TFA; система B - MeCN : 0,2% TFA; iPrOH (80:25:20). Градиент: 0-1 мин (100% A); 1-21 мин (100% A - 50% A); 21-23 мин (50% A -0% A); 23-26 мин (0% A - 100% A). Скорость 1 мл/мин, детекция при 226 нм. Пептиды охарактеризованы корректными данными аминокислотного анализа ЯМР - масс-спектров. Чистота, выход и физико-химические характеристики полученных пептидов приведены в табл. 2.

Известно, что стресс-реакция предшествует состоянию устойчивой адаптации и играет важную роль в ее формировании. При этом основные усилия организма направлены на поддержание функций жизненно важных органов и мобилизацию энергетических и структурных ресурсов. В ответ на стрессорные воздействия происходит выброс катехоламинов с последующей активацией симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарной систем. В условиях длительного воздействия раздражителя происходит истощение компенсаторных возможностей и, вследствие этого, срыв адаптационных механизмов организма. Обусловленная избытком катехоламинов активация липаз, фосфолипаз и перекисного окисления липидов клеточных мембран приводит не к физиологически выгодному изменению состава липидного бислоя, а к повреждению ультраструктуры клеток и различным патологиям.

Пример 2. Изучение антистрессорной активности пептида 1 при гипоксии.

Эксперименты проводят на белых крысах-самцах весом 180-200 г. Гипоксическую гипоксию создают в барокамере проточного типа при атмосферном давлении 196 мм рт.ст., что соответствует высоте 10 км; время экспозиции 15 мин. Пептид 1 вводят животным внутрибрюшинно в дозе 120 мг/кг за 20 мин до подъема.

Митохондриальную фракцию головного мозга получают общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Среда выделения: сахароза - 250 мМ, трис-HCl - 10 мМ, ЭДТА - 1 мМ, pH 7,4.

2.1. Определение активности моноаминооксидазы (МАО) типа А.

Активность МАО А определяют в митохондриальной фракции. В качестве субстрата используют серотонин в насыщающей концентрации. Определение активности фермента проводят по методу Горкина. Активность МАО А оценивают по освобождению аммиака после изотермической отгонки. Белок определяют по методу Лоури.

2.2. Исследование дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий мозга.

Потребление кислорода митохондриальной суспензией регистрируют полярографическим методом с использованием открытого платинового катода. Среда инкубации: сахароза - 250 мМ, трис-HCl(OH) - 10 мМ, KCl - 15 мМ, KH₂PO₄ - 20 мМ, ЭДТА - 0,5 мМ, pH 7,4. В качестве субстрата дыхания применяют 15 мМ раствор глутамата. Установлено, что под действием гипоксического стресса изменяется активность мембраносвязанных ферментов мозга животных (Рихерева Г.Т., Маклецова М. Г. и др. Изменение интенсивности свободнорадикальных реакций в органах крыс при гипокинетическом стрессе и защите дельта-сон индуцирующим пептидом и его тирозинсодержащим аналогом. - Известия РАН, 1993, N 2, с. 243-256). Например, активность митохондриальной моноаминооксидазы типа А (МАО А) из мозга крыс, подвергнутых гипоксии, снижается в среднем на 52%. Под действием предложенного пептида 1 (внутрибрюшинное введение крысам в дозе 120 мг/кг) активность фермента у животных в условиях стресса снижается только на 14% по сравнению с интактными животными. Данный результат говорит о том, что в значительной степени сохраняется способность ферментов мозга к ассоциации с митохондриальной мембраной и стабилизации тем самым энзиматических характеристик мембран митохондрий в условиях гипоксии.

Гипоксия приводит к нарушению энергетизации ткани мозга, что выражается, в частности, в снижении скорости синтеза АТР и уменьшении величины дыхательного контроля. Так, происходит снижение скорости фосфорилирования АДР при концентрации этого метаболита 50 и 75 мкМ (табл. 3). Предварительное введение пептида 1 приводит к повышению данных показателей практически до уровня интактных животных. Величина дыхательного контроля также повышается (5,67±0,86 отн. ед. ) и даже несколько превосходит значение для контрольных животных (4,01±0,14 отн.ед).

Пример 3. Исследование противосудорожной активности пептидов.

Опыты выполняют в условиях острого эксперимента на мышах линии BALB/C массой 18-22 г. Генерализованную судорожную активность вызывают введением коразола (60 мг/кг, внутрибрюшинно) в объеме 0,2-0,3 мл. Введение пептида в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг (внутрибрюшинно) осуществляют в объеме 0,2-0,3 мл физиологического раствора за 30 мин до применения коразола. В течение 30 мин после применения конвульсанта наблюдают судорожные реакции в прозрачных индивидуальных камерах (40 х 30 х 20 см). Учитывают латентный период возникновения первых и клоникотонических судорог, а также тяжесть судорожных проявлений, которые оценивают по принятой шкале. (Крыжановский Г.Н., Шандра А.А., Макулькин Р. Ф. , Годлевский Л.С. Бюллетень эксперим. биологии и медицины, 1985, т. 99, N 5, с. 527-532).

Пептиды 1-3 обладают ярко выраженным противосудорожным эффектом. Введение этих пептидов в дозах 0,1 м 1,0 мг/кг (внутрибрюшинно) приводит к значительному увеличению времени возникновения первых и клонико-тонических судорог, а также уменьшению тяжести судорог по сравнению с контрольными животными (табл. 4). Из приведенных данных видно, что заявляемые пептиды 1-3 проявляют более выраженное противосудорожное действие, чем DSIP.

При стрессорном воздействии избыток катехоламинов приводит к активизации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накоплению в тканях продуктов этой реакции, в частности малонового диальдегида (МДА). Это является одной из причин повреждения клеточных мембран, изменения активности мембраносвязанных ферментов и нарушения процессов внутриклеточного метаболизма (Шидловская Т. Е. Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях крыс при гипокеназии. - Косм. биология и авиакосм. медицина, 1985, т. 34, вып. 1, с. 19-22). В связи с этим интенсивность ПОЛ является одним из критериев, характеризующих стресс-реакцию в организме млекопитающих) (Гальдман А.В. и Александровский Ю. А. Психофармакотерапия невротических расстройств. -М.: Медицина, 1987, с.287).

Пример 4. Исследование перекисного окисления липидов и уровня ГАМК при стрессе.

Эксперименты проводят на беспородных белых крысах обоего пола весом 170-250 г.

4.1. Гипокинетический стресс.

Животных помещают в специальные камеры, резко ограничивающие их подвижность сроком на 1 ч и на 6 ч (Белова Т.И., Петрова Н.В., Юнсон Ю. Lows Geruleus: регуляция и функции гематоэнцефалического барьера в норме и в условиях эмоционального стресса. - Бюллетень эксперим. биол. и мед., 1986, т. 101, N 4, с. 395-397). В качестве контрольных животных используют крыс, которые содержатся в виварии. Введение пептида 1 осуществляют внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг за 60 мин до стрессового воздействия. Животных декапитируют, извлекают мозг и определяют уровень малонового диальдегида (Стальная И.Д., Горшивили Т.Г. Метод определения МДА с помощью ТБК. Современные методы в биологии. -М.: Медицина, 1977, с.66).

4.2. Гипербарическая оксигенация (ГБО).

Животных помещают в специальные камеры и подвергают действию 0,3 мПа кислорода в течение 2 ч. В качестве контрольных животных используют крыс, которые содержатся в виварии. Введение пептида 1 осуществляют внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг за 60 мин до стрессового воздействия. Животных декапитируют, извлекают мозг и определяют уровень малонового диальдегида (там же).

4.3. Определение содержания ГАМК в мозге животных.

Навеску ткани мозга (1 г) гомогенизируют в 10 мл 0,4 перхлорной кислоты и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Из полученной надосадочной жидкости отбирают 2 мл и выпаривают досуха на водяной бане. Остаток растворяют в 0,1 мл воды и по 0,03 мл наносят на полоски хроматографической бумаги марки "С" размером 2 х 28 см. Линия старта отстоит от катода на 14 см. Электрофорез проводят в 0,2 N натрий-ацетатном буфере (pH 4,6) при напряжении 200 В и силе тока 12 мА в течение 2 ч. Полоски высушивают и окрашивают 1% раствором нингидрина в ацетоне при температуре 90^oC. Пятна на фореграммах, соответствующие ГАМК, вырезают, измельчают и элюируют в 4 мл 50% этанола. Анализируют на спектрофотометре при длине волны 557 нм. В качестве стандарта используют синтетическую ГАМК (Sigma, США).

При гипоксинетическом стрессе происходит значительное нарастание уровня МДА - на 51% через 1 ч стрессорного воздействия и на 103% через 6 ч. Подобный эффект наблюдается и на другом типе стрессорного воздействия - гипербарической оксигенации (ГБО). Установлено, что введение пептида 1 в дозах 100-150 мг/кг (внутрибрюшинно) приводит к заметному снижению уровня МДА (табл. 5).

Стресс-реакция сопряжена с активацией ГАМК-ергической системы мозга млекопитающих и прежде всего с адаптивным увеличением интенсивности биосинтеза ГАМК (Гальдман А.В. и Александровский Ю.А. Психофармакотерапия невротических расстройств. -М. : Медицина, 1987, с.287). Однако в дальнейшем при развитии стресс-реакции происходит истощение биосинтетических возможностей и резкое уменьшение уровня ГАМК в мозге животных (табл. 6), приводящее к неблагоприятному нарушению баланса тормозных и возбуждающих нейромедиаторных аминокислот, что в свою очередь вызывает нарушения в регуляции основных функций организма. Как видно из приведенных данных, пептид 1 не только предотвращает стадию истощения ГАМК у животных в условиях 6-часового стрессорного воздействия, но и поддерживает состояние срочной адаптации, возникающее при 1-часовом стрессорном воздействии, повышая тем самым устойчивость животных к действию стрессирующего фактора.

В целом предложенный пептид 1 обладает нейропротекторным действием при стрессорных воздействиях за счет эффекта позитивной регуляции основных энергетических процессов в мозге и восстановления уровня энергизации мозговой ткани. Одновременно этот пептид снижает активность процесса перекисного окисления липидов, чем увеличивает стабильность мембран и регулирует их функциональное состояние.

Согласно современным представлениям о роли стресса в патогенезе заболеваний нервной системы, стрессорные воздействия рассматриваются как этиопатогенетический фактор постстрессорной нейросенсибилизации и последующего развития нейроиммунного конфликта. (Степаненко Е.М., Вилков Г.А., Крыжановский Г.Н. Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1984, т. 98, N 9, с.36-338; Вилков Г. А. , Степаненко Е.М., Крыжановский Г.Н. Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1987, N 9, с. 288-290).

Установлено, что одним из реальных механизмов индукции иммунных реакций на нейроантигены при стрессе является активация свободнорадикальных процессов, приводящая к нарушению структуры клеточных мембран и увеличению проницаемости гематоэнцефалитического барьера, что приводит к повышению риска контакта специфических белков мозга и клеток иммунной системы. Степень постстрессорной нейросенсибилизации прямо связана с реакцией антиоксидантных систем на стресс и различной выраженностью прооксидантных систем организма. Так, у морских свинок на модели экспериментального энцефаломиелита (ЭАЭ) легко развивается нейросенсибилизация после стресса, в то время как у белых беспородных крыс она развивается лишь после истощения естественного антиоксидантного потенциала животных путем использования месячной липидной диеты (там же). При искусственном истощении антиоксидантного потенциала у крыс резко ослаблялась их естественная толерантность к ЭАЭ, и введение им энцефалитогенной сыворотки вызывало 100%-ную заболеваемость и гибель животных. В то же время предварительное введение животным антиоксидантных средств, в том числе и антиоксиданта непрямого действия - пептида дельта-сна, существенно снижало долю заболевших животных и тяжесть заболевания.

Нейропротекторное действие пептида 1 было показано на крысах, находящихся на липидной диете, с истощенной антиоксидантной системой и подвергнутых эмоционально-болевому стрессу. В эксперименте оценивали следующие показатели: содержание кортикостерона как маркера стресса, степень активации процессов ПОЛ и антиоксидантных систем в мозге и крови хемилюминесцентным методом, а также уровень витаминов A и E в крови, содержание холестерина, диеновых конъюгатов и шиффовых оснований в мозге. Оценивалось также состояние нефромедиаторной регуляции, а именно содержание норадреналина, дофамина, серотонина и гистамина в отдельных районах мозга.

Пример 5. Исследование состояния анти- и прооксидантных процессов в мозге и крови у крыс, подвергнутых липидной диете и стрессорному воздействию.

Эксперименты проводят на беспородных белых крысах-самцах весом 170-250 г. Липидную диету (старое сало с небольшим количеством зерна) поддерживают в течение месяца. Крыс подвергают эмоционально-болевому стрессу в течение 4 ч (Стальная И.Д., Горшивили Т.Г. Метод определения МДА с помощью ТБК. Современные методы в биологии. - М.: Медицина, 1977, с.66). Пептиды вводят за 1 ч до стресса внутрибрюшинно в дозе 120 мкг/кг. Через сутки животных декапитируют и исследуют степень активации процессов ПОЛ и антиоксидантных систем хемилюминесцентным методом, а также уровень витаминов A и E в сыворотке крови (Вилков Г.А., Смирнова О.Б., Межова Л.И. Бюллетень эксперим. биол. и мед. , 1993, N 10, с. 364-366).

Оценивают также содержание гистамина в различных структурах мозга - гипоталамусе, таламусе и гиппокампе колориметрическим методом (Коробова Л.Н., Ходакова А. А. , Френкель М.Л. Лаб. дело, 1982, N 4, с. 7-10). В качестве стандарта используют гистамин фирмы "Fluka" (Швейцария).

Из полученных данных следует, что показатель хемилюминесценции - индуцированное свечение, отражающее уровень гидроперекисей, и показатель уровня антиоксидантов в системе (табл. 7) значительно ниже в группе с предварительным введением пептида 1 по сравнению с контрольной группой. При этом заявляемый пептид 1 проявляет большую эффективность действия, чем природный пептид дельта-сна. В то же время пептид 1 значительно уменьшал содержание шиффовых оснований (на 40%) и диеновых конъюгатов (на 30%) в коре больших полушарий крыс, подвергнутых липидной диете и эмоционально-болевому стрессу, что демонстрирует более низкий уровень прооксидантных процессов у животных, защищенных пептидом 1. Эти результаты согласуются и с более высоким содержанием витамина E в крови экспериментальных животных (на 30%) и с более низким уровнем кортикостерона, что также свидетельствует о снижении выраженности прооксидантных процессов и об антистрессорном действии пептида 1. Кроме того, пептид 1 проявляет способность отчетливо снижать содержание гистамина по всем исследованным структурам мозга - гипоталамусе, таламусе и гиппокампе на 76,43 и 38% соответственно при сравнении контрольных стрессированных животных и экспериментальных животных, получивших однократную дозу пептида 1 за 1 ч до стрессорного воздействия.

Полученные свидетельства четко выраженной антиоксидантной и антистрессорной активности пептида 1 позволяют прогнозировать его эффективность для лечения и профилактики ряда нейроиммунных заболеваний (энцефалиты, шизофрения, рассеянный склероз и др.).

Пример 6. Исследование токсичности пептида 1 (в соответствии с ГФ XI).

Эксперименты проводят на 10 беспородных белых мышах обоих полов массой 20-22 г. Пептиды вводят внутрибрюшинно в дозе 3 г/кг (в объеме 0,5 мл стерильного физиологического раствора). Наблюдение проводят в течение 72 ч после инъекции, при этом мыши содержатся раздельно на полноценном кормовом рационе (Государственная фармакопея СССР.-М.: Медицина, 1987, вып. XI, т.2).

В экспериментах по изучению токсичности пептида 1 было показано, что внутрибрюшинное введение пептида 1 в дозе 3 г/кг мышам не вызывало каких-либо отклонений в поведении животных и через 72 ч после инъекции пептида 1 гибели животных не зафиксировано.

Таким образом, вышеизложенные данные убедительно свидетельствуют о выраженности у заявляемых пептидов - аналогов пептида дельта-сна, противосудорожной, антистрессорной и нейропротекторной активности, что, принимая во внимание их нетоксичность для организма животных, позволяет рекомендовать их в качестве потенциальных нейропротекторных лекарственных средств для лечения и предупреждения различных форм энцефалопатий.

Использование: в медицине, как соединения, обладающие антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием. Сущность изобретения: пептиды общей формулы: Trp-X-Gly-Gly-Asp-R, где X - остаток гидроксилсодержащей аинокислоты L- или Д-конфигурации, R-Ala-Ser-Gly-Glu или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или Ala, а также их фармацевтически приемлемые соли. Синтез I осуществляют последовательным наращиванием пептидной цепи с использованием третбутилоксикарбонильной схемы твердофазного пептидного синтеза, синтез проводят в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе. 7 табл.

Пептиды общей формулы
Trp-X-Gly-Gly-Asp-R,
где X - остаток гидроксилсодержащей аминокислоты L- или D-конфигурации;
R - Ala-Ser-Gly-Glu, или Ala-Ser-Gly, или Ala-Ser, или Ala;
а также их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антистрессорным, противосудорожным и нейропротекторным действием.