ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ С КОРТИКОТРОПИНПОДОБНОЙ СТРУКТУРОЙ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИСТРЕССОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2008 года по МПК C07K7/64 C07K14/545 A61K38/12 A61K38/20 A61P25/00 

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии.

Спокойная жизнедеятельность - это только одна из форм существования живой системы. Жизнь современного человека полна неожиданностей, экстремальных событий, выходящих далеко за границы нормы реакции. Напряженная жизнедеятельность, или стресс, - столь же необходимая и постоянно встречающаяся форма существования, как и жизнедеятельность спокойная. Неизбежность стрессов обусловлена появлением в среде обитания новых, необычных или исчезновением старых необходимых раздражителей, колебаниями силы и длительности действия знакомых агентов, природными и антропогенными изменениями в биосфере. На самом деле, периодические стрессы, предпочтительно умеренные по силе и продолжительности, необходимы организму, потому что тренируют нервную, иммунную, эндокринную, а также дыхательную, сердечно-сосудистую, пищеварительную и выделительную системы, стимулируют их активность, поддерживают в оптимальном рабочем состоянии. Все стресс-агенты, при всем их разнообразии, вызывают стереотипную неспецифическую ответную реакцию, разумеется, с рядом отличий, обусловленными различиями стрессоров. Биологический смысл и назначение стресса - повысить общую сопротивляемость, неспецифическую устойчивость живой системы по отношению к действующему стимулу и другим стрессорам.

Действие стрессоров приводит к увеличению секреции гипоталамического кортикотропин-рилизинг-гормона, который по воротной системе сосудов поступает в переднюю долю гипофиза и стимулирует здесь секрецию адренокортикотропного гормона (кортикотропина, АКТГ). Кортикотропин выделяется в кровь, достигает коры надпочечников и стимулирует образование в ее клетках глюкокортикоидов. Основное жизненно важное действие глюкокортикоидов при стрессе заключается в быстром снабжении организма глюкозой за счет активации глюконеогенеза в печени. Другая важная функция этих гормонов состоит в том, что они играют пермессивную роль в действии катехоламинов на гладкую мускулатуру сосудов. При стрессе из мозгового вещества надпочечников выделяются адреналин и норадреналин, которые вызывают сокращения стенок кровеносных сосудов в скелетных мышцах. В результате происходит централизация кровообращения: повышенное поступление крови в мышцы и уменьшение кровоснабжения периферических тканей. Это действие катехоламинов проявляется только в присутствии глюкокортикоидов. Состояние организма в целом во время стресса характеризуется следующими изменениями: усиливается работа сердца, учащается дыхание, кровоток изменен таким образом, чтобы обеспечить высокую доставку субстратов окисления и гликолиза к мозгу и мышечной системе. Мозг сфокусирован на восприятие угрозы и противодействие ей. Кроме того, эндокринные программы удовольствия, роста и воспроизводства отключаются для экономии энергии. Катаболизм увеличивается и энергия используется главным образом, чтобы снабдить мозг, сердце и мышцы (Гриневич В.В., Поскребышева Е.А., Савелов Н.А. и др. Иерархические взаимодействия между органами системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники при воспалении. // Успехи физиол. наук. - 1999, - Т.30 - С.50-66).

Избыточное выделение гормонов надпочечников, вызванное продолжительным или чрезмерно интенсивным действием стрессора, может привести к патологическим процессам (некрозам, подавлению воспалительных реакций, которые являются важным биологически барьером, ограничивающим распространение инфекции в организме т.д.) и развитию болезни адаптации. Развитие стрессорного процесса в зависимости от его сложности и повреждающего эффекта может приводить к язвообразованию, дисфункции эндокринной системы, возникновению ишемической болезни сердца, гипертензии, то есть к формированию психосоматических заболеваний, которые при определенных условиях могут переходить в хроническую форму (Seres J., Stancikova M., Svik К. et al. Effects of chronic food restriction stress and chronic psychological stress on the development of adjuvant arthritis in male long evans rats. // Ann N Y Acad Sci. - 2002 - V.966 - Р.315-9). Усиление психоэмоциональной нагрузки, ухудшение экологической обстановки - все это приводит к возрастанию стрессорных воздействий и снижению адаптационных возможностей организма современного человека. Если адаптационные возможности организма оказываются исчерпанными, это служит причиной разного рода повреждений, и тогда стресс можно рассматривать как один из видов чрезвычайных воздействий на организм, приводящих к патологии висцеральных систем и к нейродистрофическим расстройствам внутренних органов (Evseeva M.E. Stress-induced rearrangement of the myocardium: time course of structural changes in various types of stress. // Bull Exp Biol. Med. - 2000. - V.130. - P.937-9).

Однако когда организм ослаблен или стрессорное воздействие оказывается чрезвычайно сильным, возникает необходимость поступления этих веществ извне. Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессу, - это важная и актуальная задача современной биохимии и фармакологии.

В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, рассматривают как потенциальные лекарственные средства нового класса. Такие качества пептидов, как быстрая реакция организма на их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты, все больше привлекают внимание фармакологов и клиницистов. Полифункциональность пептидных гормонов является лимитирующим фактором их применения в качестве лекарственных препаратов. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеплению.

Известен адаптоген стресс-корректор, пептид Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly. Фармацевтическая композиция на основе смеси диметилсульфоксида и полиэтиленоксида-400 (или диметилсульфоксида и оливкового масла), содержащая от 1 до 1000 мкг синтетического пептида на 1 кг массы животного, эффективно защищает животных от воздействия физических, эмоциональных и химических факторов внешней среды (патент РФ №2155064, МПК А61К 38/08, опубл. 2000).

Известен пептид дельта сна (DSIP), нонапептид с последовательностью аминокислот Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu, обладающий антистрессовым, стресс-протекторным, ноотропным и антинаркотическим действием. При соотношении компонентов в композиции: на 1 мг DSIP-реаферона 1·10³-10⁴ ME, обеспечивает антивирусное действие на организм с одновременным антистрессовым эффектом, повышает иммунитет (патент РФ №2211703, МПК А61К 38/08, опубл. 2003). При дополнительном введении в композицию глицина, карнозина, мелатонина препарат обладает свойствами увеличивать иммунитет организма, активизировать мозговые процессы, способствовать профилактике и лечению психоэмоциональных нарушений, вирусных заболеваний.

Известен нейропептид Y, осуществляющий поддержание или потенциирование эндогенных неврологических и нейропсихологических эффектов систем нейропептида Y головного мозга (NPY) введением ингибиторов дипептидилпептидазы IV (DP IV) и DP IV-подобных ферментов. С его помощью можно лечить гипертензию, лихорадочное состояние, расстройства сна, анорексии, связанные с тревожностью нарушений, в том числе депрессии, припадков, в том числе эпилепсии, синдрома отмены лекарственного средства и алкоголизма, нейродегенеративных нарушений, в том числе нарушения когнитивной функции и деменции, и психоневрологических нарушений, в том числе шизофрении, через потенциирование опосредованных рецептором Yl NPY эффектов в центральной нервной системе (ЦНС) (патент РФ №2286149, МПК 31/40, опубл. 2006).

Недостатками вышеперечисленных препаратов являются их сложная композиция, в данном сочетании они могут вызывать аллергии. Перечисленные пептиды не решают задачу безопасного, эндогенного препарата, нормализующего в целом систему гипоталамус-гипофиз-надпочечники, приводящем в норму показатели за счет естественных механизмов регуляции ответа на стресс. Препараты нельзя принимать как в бытовых условиях, так и при госпитализации без необходимости длительного лечения и без побочных эффектов. Препараты вызывают притупление внимания, снижение уровня активности, сонливость и миорелаксацию.

Известен наиболее близкий к заявленному фрагмент 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека (GK-VLKKRR), более чем на 80% подобный фрагменту кортикотропина 10-18 (GKPVGKKRR). Октапептид GKVLKKRR (авторское название - лейкоккортикотропин) с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором кортикотропина на спленоцитах и макрофагах мыши (Zav'yalov VP, Maiorov VA, Safonova NG, et al. Receptor-binding properties of the peptides corresponding to the ACTH-like sequence of human pro-interleukin-1α. // Immunol. Lett. - 1995 - V.46 - P.125-128). Меченый тритием лейкокортикотропин с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором кортикотропина коры надпочечников крысы (К_d, 2,2±0,1 нМ). В диапазоне концентраций 1-1000 нМ пептид не влияет на активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы. При троекратном интраназальном введении в дозах 10-20 мкг/животное лейкокортикотропин практически не изменяет уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс в отсутствие термического воздействия. В то же время, при холодовом или тепловом шоке пептид отменяет (доза 20 мкг/животное троекратно) или значительно уменьшает (доза 10 мкг/животное троекратно) резкое возрастание содержания КС в надпочечниках, вызванное шоком. Таким образом, лейкокортикотропин способен нормализовать уровень КС в коре надпочечников крысы при стрессе. К недостаткам известного соединения относится недостаточно высокая стресспротекторная активность пептида.

Для лечения состояния стресса наибольший интерес представляет первоначальная реакция на стресс-фактор - фаза тревоги или мобилизации. Истинно стрессорные (неспецифические) реакции преобладают лишь на стадии тревоги. Многообразие процессов, происходящих на первой стадии общего адаптационного синдрома позволило выделить 4 фазы этого процесса: 1 - катаболическая (возбуждение рецепторов адренергических и дофаминергических структур, щитовидной железы, выделение липотропина, глюкагона), 2 - переходная (блокада вышеуказанных рецепторов и уменьшение выделения гормонов щитовидной железы, липотропина и глюкагона), 3 - анаболическая (возбуждение рецепторов холинергических, серотонинергических и других структур, выделение адренокортикотропного гормона (АКТГ), инсулина, эндорфинов, энкефалинов), 4 - эффекторная (восстановление гомеостаза, синтез белков, иммунные реакции, адаптация, тренированность или патология). Регулирование этих процессов с помощью циклопептидов I и II приводит в последующем к повышению резистентности организма к стресс-фактору и функционированию органов и систем на должном для этой ситуации уровне. Наряду с этим происходят репарационные процессы, направленные на восстановление повреждений, вызванных действием стресса.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу.

Поставленная задача решается за счет пептида, имеющего следующую аминокислотную последовательность:

cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)_n,

где n=2-3.

Заявляемые циклопептиды I (n=2) и II (n=3) способны нормализовать содержание 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия. Троекратное интраназальное введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием.

К числу важнейших приспособительных реакций относится авторегуляция активности диаминоксидазы (гистаминазы) - фермента, катализирующего реакцию дезаминирования гистамина и предотвращающего его накопление в организме в токсических количествах. При стрессовых воздействиях в результате их чрезмерной интенсивности или понижения адаптационных возможностей организма равновесие в системе гистамин - диаминоксидаза (ДАО) нарушается (Akhalaia M.Yu., Goncharenko E.N., Kudriashova N.Yu. Effect of natural radioprotector camosine on histamine-diamineoxidase system of rat's myocardiumafter action of various extreme factors. // Radiats Biol. Radioecol. - 2001 - V.41 - P.56-58). Способность поддерживать стационарное состояние системы гистамин - ДАО при развитии стрессовых состояний рассматривают в качестве одного из показателей адаптационных возможностей организма. Особое значение для адаптации организма к функциональным перегрузкам имеет состояние сердечно-сосудистой системы, для нормального функционирования которой необходима устойчивость системы гистамин - ДАО. В связи этим способность кортикотропинподобных циклопептидов поддерживать на стационарном уровне систему гистамин - ДАО в миокарде крыс, подвергнутых холодовому и тепловому воздействиям, является несомненным преимуществом.

Таким образом, техническим результатом предполагаемого изобретения является высокая стресс-протекторная активность пептидов, сочетаемая с узконаправленным действием, что позволяет рассматривать их в качестве основы для создания безопасных лекарственных средств повышающих устойчивость организма к различным стрессовым воздействиям (холодовому, тепловому, гипоксии, геморрагии).

Циклопептиды I и II состоят из 16 и 24 аминокислотных остатков соответственно, т.е. являются сравнительно небольшими молекулами, что упрощает их получение химическим синтезом. Кроме того, циклическая форма пептидов продлевает время жизни пептидов в активной среде, т.к. делает их более устойчивыми к действию протеаз. Это позволяет увеличить время действия и усилить эффект действия пептидов.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Химический синтез линейного прототипа - лейкокортикотропина.

Лейкокортикотропин (GKVLKKRR) получают методом твердофазного синтеза с последовательным наращиванием пептидной цепи. Защищенный пептид получают по методике in situ соответствующих амино-ацил полимерах с емкостью 0,7 ммоль/г, используя синтезатор Applied Biosystems 430 A. В качестве постоянных защитных групп используют мезитилен-2-сульфонильную (для аргинина) и 2-хлорбензилокси-карбонильную (для лизина). Трет-бутилоксикарбонильную группировку используют в качестве временной защиты альфа аминогрупп. Удаление боковых защитных группировок и отщепление пептида от полимера проводят под действием безводного фтористого водорода в присутствии м-крезола.

Лейкокортикотропин очищают с помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (хроматограф Gilson, Франция, колонка Prep.Nova-Pak HR С 18,49×300 мм, зернистость 6 мкм) и характеризуют данными аналитической ОФ ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak С 18 100 Å, 3.9×150 мм, 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 20-50%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США). Аминокислотный состав лейкокортикотропина соответствует теоретическому. Основные характеристики пептида приведены в таблице 1.

Для определения аминокислотного состава пептида используют аминокислотный анализатор 4151 Alpha Plus Biochrom (LKB, Швеция) и интегратор 2220 Recording Integrator Bromma (LKB, Швеция).

Для приготовления гидролизата взвешивают 1 мг исследуемого образца пептида, помещают его в специальную ампулу, прибавляют 1 мл 6N HCl и запаивают. Ампулу выдерживают в термостате при 110°С в течение 22 часов. Затем ампулу вскрывают, содержимое переносят в круглодонную колбу и упаривают на роторном испарителе. Остаток растворяют в 0,5 мл стартового буфера, рН 2,2. Объем запускаемого образца составляет 10-50 мл. Аминокислотный состав рассчитывают при сравнении хроматограмм образца и стандартной калибровочной смеси аминокислот.

Структуру очищенного вещества подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Voyager-DE BioSpectrometry Workstation (Per Sepetive Biosystems, США) с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном 700-3500 Да (Bruker Daltonik, Германия).

Пример 2. Химический синтез циклического аналога лейкокортикотропина.

Циклические аналоги лейкокортикотропина получают методом твердофазного синтеза пептидов с последовательным наращиванием пептидной цепи. Защищенный пептид получают по методике in situ на оксим-полимере с нагрузкой 0,5-0,9 ммол/г, используя синтезатор пептидов Vega Coupler C250 в полуавтоматическом режиме (Nakagawa, S.H., and Kaiser, E.T. Synthesis of protected peptide segments and their assembly on a polymer-bound oxime: application to the synthesis of a peptide model for plasma apolipoprotein A-I. // J. Org. Chem. - 1983 - V.48 - P.678-685). В качестве постоянных защитных групп используют 2-хлорбензилоксикарбонильную группировку для лизина и мезитилен-2-сульфонильную для аргинина. Трет-бутилоксикарбонильную группировку используют в качестве временной защиты альфа аминогрупп. На стадии деблокирования ее удаляют 25% раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене.

Посадку первой аминокислоты на оксим-полимер осуществляют методом симметричных ангидридов, используя 2-кратный избыток симметричного ангидрида Вос-Gly-OH, а в качестве катализатора 0,1 эквивалента диметиламинопиридина. Реакцию проводят в смеси диметилформамида и N-метилпирролидона в соотношении 1:1 в течение 20 часов.

Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру методом оксибензотриазоловых эфиров, используя 5-кратные избытки соответствующих производных аминокислот. Для активации 1 экв. аминокислоты используют 1 экв. гидроксибензотриазола и 1 экв. диизопропилкарбодиимида. Активацию проводят при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакции проводят в диметилформамиде в течение 30 минут. Объем реакционной смеси составляет 15 мл на 1 г сухого полимера. Содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально при помощи качественного нингидринового теста.

Циклизацию пептида проводят обработкой раствором уксусной кислоты (10 экв.) в диметилформамиде в присутствии диизопропилэтиламина (4 экв.) в течение 20 часов. Деблокирование боковых защитных групп осуществляют безводным жидким фтористым водородом в присутствии скавенджеров. Для этого после упаривания диметилформамида на роторном испарителе защищенный циклический пептид растворяют в хлористом метилене и переносят в сосуд для работы с жидким фтористым водородом. Хлористый метилен упаривают на водоструйном насосе, остаток обрабатывают безводным жидким фтористым водородом в присутствии мета-крезола при 0°С в течение 30 минут. Фтористый водород упаривают в вакууме водоструйного насоса, продукт растворяют в трифторуксусной кислоте и затем высаживают из диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают в эксикаторе до постоянного веса.

С помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (хроматограф Gilson, Франция, колонка Prep. Nova-Pak HR С 18, 49×300 мм, 6 мкм) выделено два мажорных продукта синтеза. Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% (v/v) в 0,1% трифторуксусной кислоте в течение 30 минут со скоростью элюции 5 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 220 нм. Оба пептида характеризуют данными аналитической ОФ ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция, колонка Luna Phenomenex С 18 (2) 100Å, 4,6×150 мм, 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 5-35%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США) (все анализы проводят, как описано в примере 1). Содержание примесей в синтетических препаратах не превышает 4%. Данные приведены в таблице 1.

Анализ полученных экспериментальных данных показывает, что первый пептид с молекулярной массой 967,42 является циклическим мономером лейкокортикотропина, а второй пептид с массой 1933,29 его циклическим димером. Циклический димер получен с наибольшим выходом (20%), что, по-видимому, связано с тем, что данный цикл является наименее напряженным.

Пример 3. Химический синтез циклопептида II.

Все первоначальные стадии проводят, как описано выше (см. пример 2). В дополнительном эксперименте оставшийся после стадии циклизации полимер промывают хлористым метиленом, высушивают до постоянного веса и обрабатывают безводным жидким фтористым водородом в условиях, аналогичных вышеописанным. Полученный продукт очищают до гомогенного состояния и характеризуют по вышеописанным методикам (пример 1). Анализ полученных характеристик показывает, что это соединение является циклическим тримером лейкокортикотропина. Измеренная моноизотопная молекулярная масса циклического триммера составляет 2901,30.

Таблица 1.
Характеристики синтезированных пептидов.ПептидВремя выхода, минЧистота по данным ВЭЖХ, %Данные аминокислотного анализаМолекулярная масса по данным масс-спектрального анализаВыход, %Лейкокортикотропин (GKVLKKRR)8,48>95Gly-1,12(1)
Val-0,98(1)985,3558Leu-1,00(1)Lys-3,26(3)
Arg-2,06(2)Цикломономер7,90>95Gly-1,10(1)
Val-0,96(1)967,421,5Leu-1,02(1)Lys-3,28(3)
Arg-2,04(2)Циклодимер9,71>95Gly-1,11(1)
Val-0,99(1)1933,2920Leu-1,05(1)Lys-3,21(3)
Arg-2,02(2)Циклотример9,99>90Gly-1,13(1)
Val-0,98(1)2901,304Leu-1,01(1)Lys-3,23(3)
Arg-2,02(2)

Пример 4.

Определение влияния циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на уровень кортикостероидов и катехоламинов в крови и надпочечниках на моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у крыс in vivo.

В экспериментах используют половозрелых самцов крыс линии Wistar массой 180-200 г. Моделью острой геморрагии служит 1-часовая артериальная гипотензия. Для ее создания у наркотизированных крыс (нембутал 40 мг/кг) через катетер в хвостовой артерии производят взятие крови до достижения среднего артериального давления 40 мм ртутного столба. До начала кровопотери животным внутривенно вводят гепарин (0,5 мл, 50 ЕД/мл) для предотвращения свертывания крови во время проведения длительного эксперимента. По истечении времени гипотензии крыс реанимируют путем внутриартериального введения взятой крови. Сразу после восполнения кровопотери проводят внутривенную инфузию исследуемого пептида (1 и 10 мкг/кг/мин в течение 10 мин) или аналогичного объема (0,8 мл) физиологического раствора через яремную вену. Поскольку, как правило, регуляторные пептиды имеют каскадный механизм действия, и их влияние может сказываться через длительное время после введения, декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводят на 1-е и 7-е сутки. Контрольной группе животных проводится полная операция без геморрагического шока. Значения биохимических показателей в этой группе принимают за 100%. Контрольные и опытная группы содержат по 10 крыс.

Для создания условий развития острой гипобарической гипоксии крыс помещают в барокамеру с давлением 154 мм ртутного столба, соответствующим атмосферному давлению на высоте 11500 м от уровня моря, и выдерживают в этих условиях до принятия ими бокового положения. Исследуемые пептиды крысам опытной группы вводят интраназально (0,1 и 1 мкг/кг массы тела животного) за 1 и 24 часа до "подъема", параллельно крысам контрольной группы вводят физиологический раствор. Декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводят на 1-е и 7-е сутки после "подъема". Значения биохимических показателей в контрольной группе принимают за 100%. Каждая группа содержит по 10 животных.

Содержание глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов) в надпочечниках и крови определяют по методу (Udenfriend, S. Fluorescense assay in biology and medicine. Academic Press, New York, London, 1962, 341-346; Navolotskaya, E.V., Vanina, V.I., Zolotarev, et al. Synthetic peptide immunocortin stimulates the production of 11-oxycorticosteroides by rat adrenal cortex through ACTH receptors. // Regulatory Peptides. - 2004 - V.119 - P.99-104), принцип которого основан на способности 11-оксикортикостероидов флюоресцировать после обработки смесью серной кислоты и этилового спирта (3:1, V/V). Гормоны из ткани экстрагируют с помощью хлороформа. Содержание флюоресцирующих продуктов измеряют на флуориметре "Hitachi 850" (Япония) при λ, (длине волны) 530 нм (λ возбуждающего света = 470 нм). Количество 11-оксикортикостероидов определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Для статистической обработки результатов используют t-критерий Стьюдента.

Содержание катехоламинов в надпочечниках определяют по методу (Metcalf, G.A rapid method for the simultaneous determination of noradrenaline, dopamine and 5HT in small samples of brain tissue. // Anal. Biochem. - 1974 - V.57 - P.316-320). Экстракцию катехоламинов из ткани проводят последовательной обработкой гомогената кислым n-бутанолом, смесью n-гептана и воды (4,5:1, по объему). Затем к водной фазе добавляют 2 М ацетат натрия, содержащий 0,2% ЭДТА и алюминий по Брокману I. После центрифугирования (5 минут при 2000 g) сорбент промывают водой, переносят в 0,5 М фосфатный буфер, рН 6,0, содержащий 0,75% ЭДТА, и помещают на 15 минут в шейкер для элюирования катехоламинов, а затем снова центрифугируют. Флюоресцирующие продукты катехоламинов получают с помощью тригидроксииндольной реакции (Chang С.С. A sensitive method for spectrophotofluorometric assay of catecholamines. // Int. J. Neuropharmacol. - 1961. - V.3. - P.643-649). Измерение флюоресценции проводят на флуориметре "Hitachi 850" (Япония) для адреналина при λ=500 нм и возбуждающем свете с λ=410 нм и для норадреналина при λ=485 и λ=385 нм соответственно. Количество адреналина и норадреналина определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Достоверность различий экспериментальных данных между контролем и опытом оценивают по t-критерию Стьюдента.

Данные о влиянии циклопептидов I и II и их прототипа на содержание 11-оксикортикостероидов (ЛС) и катехоламинов (адреналина и норадреналина) в надпочечниках и плазме крови крыс на 1-е и 7-е сутки постреанимационного периода после геморрагического шока приведены в таблице 2. Видно, что через 1 сутки после шока уровень КС в надпочечниках и плазме возрастает на 61 и 52% соответственно. Через 7 суток содержание КС в надпочечниках и плазме снижается, оставаясь выше контрольного уровня на 20% и 33%, соответственно. Введение пептида-прототипа в дозе 1 мкг/кг приводит к уменьшению содержания КС в надпочечниках и плазме как через 1, так и через 7 суток, увеличение дозы до 10 мкг/кг сопровождается дальнейшим снижением уровня гормонов. Циклопептиды I и II проявляют значительно большую активность: введение любого из них в дозе 10 мкг/кг нормализует содержание КС в надпочечниках и плазме. Данные табл.2 показывают, что через 1 сутки после шока концентрация адреналина и норадреналина в надпочечниках снижается по сравнению с контрольным уровнем на 35% и 26% соответственно, а через 7 суток эти показатели близки к контрольным значениям. Напротив, через 1 час после шока содержание адреналина в плазме возрастает на 86%, а через 7 суток превышает контрольный уровень на 29%. Резкое снижение содержания адреналина в надпочечниках через 1 час после шока и одновременный рост его в плазме свидетельствует об увеличении секреции гормона из надпочечников в кровь. Ведение пептида-прототипа в дозах 1 и 10 мкг/кг уменьшает данный эффект: содержание адреналина через 1 и 7 суток после шока в железе возрастает, а в плазме снижается. Циклопептиды I и II характеризуются большей активностью: в дозе 1 мкг/кг любой из них приводит содержание адреналина в надпочечниках и плазме к контрольному уровню. Таким образом, циклопептиды I и II в дозах 1 и 10 мкг/кг устраняют резкие изменения уровней КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс, вызываемые геморрагическим шоком. Активность пептидов убывает в ряду: циклопептид II > циклопептид I >> пептид-прототип.

В табл.3 приведены результаты исследования влияния циклопептидов I и II и пептида-прототипа на содержание КС и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс на 1-е и 7-е сутки после гипобарической гипоксии. Видно, что характер изменений содержания гормонов в надпочечниках и плазме после "подъема" такой же, как и в случае геморрагического шока. Введение пептида-прототипа в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до "подъема" корригирует, а циклопептидов I и II нормализует содержание КС и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых гипоксии.

Циклопептиды I и II способны нормализовать содержание 11-оксикортико-стероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия.

Пример 5.

Определение влияния циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на уровень кортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и содержание свободного гистамина и активности диаминоксидазы в сердечной мышце на моделях холодового и теплового шока у крыс in vivo.

Для создания модели холодового шока крыс выдерживают в состоянии свободного плавания в кювете с водой при температуре 4°С в течение 3 минут. Для теплового воздействия животных помещают в вентилируемую термокамеру при температуре 40°С на 1 час. Растворы исследуемых пептидов (10 и 20 мкг/животное) или физиологический раствор вводят интраназально три раза за 3, 2 и 1 сутки до шока. Контрольная группа животных не подвергается термическому воздействию. Значения биохимических показателей в этой группе принимают за 100%.

Содержание глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов, КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс определяют, как описано выше.

Содержание свободного гистамина в сердечной мышце крыс определяют по методу (Romberg A.L., Hakanson R. A simplified procedure for the fluorometric determination of histamine in rat stomach. // Agents Actions. - 1984. - V.14. - P.195-199), а активность фермента диаминоксидазы (ДАО) - по методу (Leyton G.B. A simple routine method for mono and diamine oxidase estimation in human serum. // Pathology. - 1981. - V.13. - P.327-333). Для экстракции гистамина ткань гомогенизируют в 0,4N хлорной кислоте, гомогенат центрифугируют. К 4 мл надосадочной жидкости добавляют смесь 0,5 мл 5N NaOH и 10 мл n-бутанола, содержащую 1,5 г NaCl. Затем после 5-минутного встряхивания смесь центрифугируют и из водной фазы, содержащей гистамин, отбирают аликвоту (2 мл) для проведения реакции конденсации с о-фталевым альдегидом (1%-ный раствор в метаноле, 4 мин). Флуоресценцию измеряют на флуориметре "Hitachi 850" (Япония) при λ=450 нм и возбуждающем свете с λ=365 нм. Количество гистамина определяют по калибровочной кривой и выражают в микрограммах на 1 г ткани. Активность ДАО оценивают по убыванию субстрата (гистамина) и выражают в мкг гистамина за 1 час в 1 г ткани. При статистической обработке результатов достоверность различий между опытом и контролем оценивают по t-критерию Стьюдента.

В табл.4 представлены данные о влиянии циклопептидов I и II и пептида-прототипа на содержание (КС) и катехоламинов (адреналина и норадреналина) в надпочечниках и плазме крови крыс после холодового и теплового шока. Видно, что как холодовое, так и тепловое воздействие приводит к значительному увеличению (в 2,5-3 раза) содержания КС и адреналина в надпочечниках и плазме. Пептид-прототип (дозы 10 и 20 мкг/животное троекратно) оказывает значительное корригирующее действие на уровень КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме. Циклопептиды I и II проявляют большую активность: в дозе 20 мкг/животное троекратно они отменяют резкое возрастание содержания КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме, вызванное температурным воздействием.

В табл.5 приведены данные о влиянии циклопептидов I и II и пептида-прототипа на активность диаминоксидазы (ДАО) и содержание свободного гистамина в миокарде крыс после холодового и теплового шока. Видно, что у крыс, подвергнутых холодовому шоку, активность фермента резко снижается (до 37% от контрольного уровня), а тепловому, напротив, значительно возрастает (на 60%). В то же время, содержание свободного гистамина незначительно возрастает как при холодовом, так и при тепловом шоке (на 10 и 22% соответственно). Введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10 и 20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до шока предотвращает резкие изменения активности ДАО и нормализует содержание свободного гистамина в сердечной мышце. Пептид-прототип проявляет значительно меньшую антистрессорную активность.

Троекратное интраназальное введение циклопептидов I и II крысам в дозах 10-20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием.

Таблица 2.
Влияние циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс в постреанимационном периоде после геморрагического шока.ГормонГруппа животныхУровень гормона (%)Через 1 суткиЧерез 7 сутокКС в надпочечникахКонтроль100±8*100±8* (33±3 мкг/г)(36±3 мкг/г)ГШ + ФР***161±13*120±8*ГШ + прототип (1 мкг/кг)139±11*116±8*ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)127±10*107±9*ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)119±11*105±8*ГШ + прототип (10 мкг/кг)128±10*106±11*ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг)
ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)104±11*
102±12*98±10*
99±9*КС в плазмеКонтроль100±9*100±9* (0,39±0,04 мкг/мл)(0,30±0,03 мкг/мл)ГШ + ФР***152±8*133±11*ГШ + прототип (1 мкг/кг)142±8*122±9*ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)129±9*111±8*ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)117±9*109±9*ГШ + прототип (10 мкг/кг)118±7**112±8*ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг)
ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)100±8*
102±10*104±8*
97±9*Адреналин в надпочечникахКонтроль100±13*100±15* (431±56 мкг/г)(448±67 мкг/г)ГШ + ФР***65±9*118±12*ГШ + прототип (1 мкг/кг)72±7**112±9*ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)89±8*103±9*ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)97±9*100±9*ГШ + прототип (10 мкг/кг)86±7**107±10*ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг)
ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)100±10*
100±8*99±9*
100±9*Адреналин в плазмеКонтроль100±10*100±15* (40,8±4,1 мкг/мл)(28,5±4,3 мкг/мл)ГШ + ФР***186±11*129±12*ГШ + прототип (1 мкг/кг)165±10*118±11*ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)108±9*108±10*ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)106±10*104±11*ГШ + прототип (10 мкг/кг)139±6**110±9*ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг)
ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)105±8*
98±9*100±9*
97±10*Норадреналин в надпочечникахКонтроль100±10*100±13* (210±21 мкг/г)(196±26 мкг/г)ГШ + ФР***74±8*109±12*ГШ + прототип (1 мкг/кг)88±10*107±10*ГШ + циклопептид I (1 мкг/кг)98±9*98±10*ГШ + циклопептид II (1 мкг/кг)100±10*99±10*ГШ + прототип (10 мкг/кг)92±6**105±7**ГШ + циклопептид I (10 мкг/кг)
ГШ + циклопептид II (10 мкг/кг)100±9*
99±10*99±9*
98±9**Р<0.02, **Р<0.001
***Геморрагический шок + физиологический раствор

Таблица 3.
Влияние циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс после гипобарической гипоксии.ГормонГруппа животныхУровень гормона (%)Через 1 суткиЧерез 7 сутокКС в надпочечникахКонтроль100±12*100±10* (34±4 мкг/г)(36±4 мкг/г)ГГ + ФР***168±12*118±10*ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)142±12*115±10*ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)121±10*100±11*ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)115±11*102±12*ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)123±8*108±9*ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды)
ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)99±11*
100±12*100±11*
97±10*КС в плазмеКонтроль100±9*100+10* (0,33±0,03 мкг/мл)(0,35±0,04 мкг/мл)ГГ + ФР***144±9*133±10*ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)130±10*125±7*ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)109±10*107±10*ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)103±12*100±9*ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)118±7**110±8*ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды)
ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)102±10*
98±9*100±10*
103±12*Адреналин в надпочечникахКонтроль100±13*100±12* (412±54 мкг/г)(422±51 мкг/г)ГГ + ФР***82±10*109±12*ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)90±6**102±12*ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)95±10*100±10*ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)98±10*104±10*ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)94±7**106±13*ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды)
ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)101±11*
100±10*100±12*
100±10*Адреналин в плазмеКонтроль100±12*100±11* (32,4±3,9 мкг/мл)(29,2±3,2 мкг/мл)ГТ + ФР***166±12*118±12*ГГ + прототип (0,1 мкг/кг дважды)136±11*110±10*ГГ + циклопептид I (0,1 мкг/кг дважды)119±10*100±10*ГГ + циклопептид II (0,1 мкг/кг дважды)112±11*104±12*ГГ + прототип (1 мкг/кг дважды)117±6**106±9*ГГ + циклопептид I (1 мкг/кг дважды)
ГГ + циклопептид II (1 мкг/кг дважды)102±10*
97±10*102±10*
99±11**Р<0.02, **Р<0.001
***Гипобарическая гипоксия + Физиологический раствор

Таблица 4Влияние циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс после холодового и теплового шока.ГормонГруппа животныхУровень гормона (%)КС в надпочечникахКонтроль100±12* (37±4 мкг/г)ХШ + ФР**259±21*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)166+15*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)139±13*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)111±12*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)100±10*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)106+11*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)98±12*ТШ + ФР***304±27*ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)173±12*ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)133±11*ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)124±12*ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)106±11*ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)
ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)119±12*
103±11*КС в плазмеКонтроль100±10* (0,39±0,04 мкг/мл)ХШ + ФР**212±25*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)152±10*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)130±11*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)118±12*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)109±12*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)115±10*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)104±11*ТШ + ФР***276±33*ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)160±17*ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)133±15*ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)108±10*ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)96±11*ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)
ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)100±10*
99±11*Адреналин в надпочечникахКонтроль100±15* (408±61 мкг/г)ХШ + ФР**298±28*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)169±14*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)131±12*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)119±12*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)111±10*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)115±13*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)94±10*ТШ + ФР***335±34*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)176±18*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)145±13*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)126±14*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)104±11*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)
ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)116±14*
95±13*Адреналин в плазмеКонтроль100±10* (32,2±3,2 мкг/мл)ХШ + ФР**255±23*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)150±10*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)114±12*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)100±11*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)102±13*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)112±10*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)97±9*ТШ + ФР***304±30*ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)142±16*ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)125±12*ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)108±10*ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)103±9*ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)
ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)104±12*
98±10*Норадреналин в надпочечникахКонтроль100±10* (224±22 мкг/г))ХШ + ФР**174±21*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)135±12*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)118±11*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)100±10*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)94±12*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)105±10*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)97±10*ТШ + ФР***238±28*  ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)153±14*ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)120±10*ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)103±11*ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)100±10*ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)
ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)100±13*
104±14**Р<0.02
**Холодовой шок + физиологический раствор
***Тепловой шок + физиологический раствор

Таблица 5
Влияние циклопептидов I и II и их прототипа - фрагмента 81-88 предшественника интерлейкина-1α человека на активность диаминоксидазы (ДАО) и содержание свободного гистамина в миокарде крыс после холодового и теплового шока.Группа животныхАктивность ДАО (%)Содержание свободного гистамина(%)Контроль100±14*100±12*(37,2±5,3 мкг
гистамина/г ткани/час)(3,5±0,4 мкг/г ткани)ХШ + ФР**37±6*110±9*ХШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)62±12*108±11*ХШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)79±10*102±12*ХШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)90±12*102±11*ХШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)89±12*98±12*ХШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)94±11*100±11*ХШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)99±12*98±12*ТШ + ФР***160±13*122±10*ТШ + прототип (10 мкг/крыса трижды)134±11*114±11*ТШ + прототип (20 мкг/крыса трижды)122±10*106±10*ТШ + циклопептид I (10 мкг/крыса трижды)112±11*104±11*ТШ + циклопептид I (20 мкг/крыса трижды)98±9*94±10*ТШ + циклопептид II (10 мкг/крыса трижды)110±11*104+11*ТШ + циклопептид II (20 мкг/крыса трижды)98±9*96±10**Р<0.02
**Холодовой шок + физиологический раствор
***Тепловой шок + физиологический раствор

Изобретение относится к биохимии, конкретнее к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии. Изобретение решает задачу расширения ряда безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу за счет циклопептидов I и II, имеющих следующую аминокислотную последовательность: Cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)n, где n=2-3. 5 табл.

Циклические пептиды с кортикотропинподобной структурой, проявляющие антистрессовую активность, имеющие следующую аминокислотную последовательность:

Cyclo(Gly¹-Lys²-Val³-Leu⁴-Lys⁵-Lys⁶-Arg⁷-Arg⁸)n,

где n=2-3.