СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА δ СНА Российский патент 1998 года по МПК C07K7/06 C07K1/02 A61K38/08 

Описание патента на изобретение RU2111972C1

Изобретение относится к области природных физиологически активных пептидов, конкретно к усовершенствованному способу получения пептида δ -сна формулы I:
TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu
Пептид δ-сна обладает антистрессорной [1], противоалкогольной [2], антиметастатической [3] и другими видами биологической активности.

В основе известных способов получения пептида δ-сна лежит конденсация Nα-защищенного тетрапептида TrpAlaGlyGly с пентапептидом последовательности AspAlaSerGlyGlu. Известен способ [4], согласно которому пептид δ-сна получают конденсацией NαZ-защищенного тетрапептида, активированного по C-концу методом смешанных ангидридов с изобутилхлорформиатом, с защищенным (бензильными группировками) пентапептидом структуры Asp(OBzl)AlaSer(Bzl)ClyGlu(OBzl)2 с последующим гидрированием полученного защищенного нонапептида над Pd-чернью для снятия защитных групп и очисткой целевого продукта на DEAE-сефадексе. Использование процесса гидрирования для снятия защитных групп приводит к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5, 6]. Кроме того, процесс гидрирования в данном случае плохо воспроизводим и трудно доходит до конца из-за осаждения на катализаторе из раствора продуктов неполного гидрирования. Выход пептида δ-сна не превышает 56%.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ получения пептида δ-сна, включающий конденсацию п-нитрофенилового эфира NαZ-защищенного тетрапептида с незащищенным пентапептидом в водно-диоксановой среде, снятие защитной Z-группы гидрированием над Pd-чернью и очистку целевого пептида ионообменной хроматографией [7]. Использование процесса гидрирования для снятия защитных групп, как и в предыдущем способе, приводит к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5, 6]. Способ позволяет получать пептид δ-сна с выходом 52%.

Предлагаемый усовершенствованный способ получения пептида δ-сна основан на конденсации пентафторфенилового эфира Boc-защищенного тетрапептида формулы II
BocTrpAlaGlyGlyOPfp
с пентапептидом формулы III

где X - ацетил или формил,
в диметилформамиде в присутствии N-метилморфолина с последующим удалением Boc-группы с помощью муравьиной кислоты при температуре от -2 до +8oC, затем ацетильной или формильной группы - в щелочных условиях, и хроматографической очисткой целевого продукта.

Отличия заявляемого способа от известного [7] заключаются в том, что исходный тетрапептид используется в виде пентафторфенилового эфира и имеет Boc-защиту по N-концу, а исходный пентапептид имеет ацильную защиту по гидроксильной группе серина и конденсацию осуществляют в присутствии N-метилморфолина в диметилформамиде (ДМФА). Кроме того, для снятия защитных групп не используется процесс гидрирования. Boc-группу отщепляют с помощью муравьиной кислоты при температуре от -2 до +8oC, а ацильную группу - в щелочных условиях.

Использование вышеизложенных отличий в заявляемом способе позволяет предотвратить ряд побочных процессов, что дает возможность получать пептид δ-сна с выходом не менее 70%.

Преимуществом заявляемого способа является отсутствие процесса гидрирования для снятия защитных групп на заключительной стадии, т.к. использование последнего может приводить к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5, 6]. В отличие от известных в заявляемом способе удаление защитных групп осуществляется в более мягких, легко контролируемых и воспроизводимых условиях.

Преимущества заявляемому способу придает также и то обстоятельство, что исходный пентапептид вводится в синтез в виде N-метилморфолиновой соли (которая образуется после того, как в раствор пентапептида в диметилформамиде добавляется N-метилморфолин). Существенное значение для синтеза имеет высокая растворимость N-метилморфолиновой соли в ДМФА, обеспечивающая высокий выход при образовании пептидной связи.

Известно, что при использовании в синтезе пептидов со свободными карбоксильными группами (в нашем случае - пентапептид) могут протекать процессы переэтерификации [8] или образования смешанных ангидридов, приводящие к получению пептидов незаданной структуры. Однако в описываемом способе вышеуказанные реакции не протекают.

Обычным способом защиты гидроксильной группы серина является введение бензильной или трет-бутильной группы [5]. В заявляемом способе используется ацильная защитная группа, но это не приводит к протеканию побочных процессов, что, по-видимому, обусловлено структурой пентапептида.

Известно, что при наличии в структуре пептида последовательности AspAla могут протекать реакции транспептидации и образования имида [9]. Кроме того, наличие свободной карбоксильной группы может приводить в присутствии активированного эфира N-концевого компонента к переэтерификации по β-карбоксильной группе аспарагиновой кислоты [10]. Однако в заявляемых условиях синтеза вышеупомянутые побочные процессы идут крайне незначительно, что подтверждается данными ТСХ и высоким выходом конечного продукта.

Также неочевидным является использование Boc-группы для защиты остатка триптофана. Известно, что при деблокировании Boc-защищенных пептидов могут получаться трудноотделимые продукты трет-бутилирования триптофана [6, 8]. В заявляемом способе благодаря структуре промежуточного пептида и подобранным условиям деблокирования удается избежать побочного процесса трет-бутилирования.

Необходимо также отметить, что при синтезе триптофансодержащих пептидов остаток триптофана часто защищают по индольному азоту для предотвращения протекания побочных реакций с участием гетероцикла [9]. В заявляемом способе используется пентафторфениловый эфир триптофансодержащего тетрапептида, при этом при его получении и использовании не требуется защита индольного атома азота.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом (см. чертеж). Сначала получают тетрапептид и пентапептид методом ступенчатого наращивания пептидной цепи, с использованием активированных эфиров аналогично [4]. Пентафторфениловый эфир Boc-защищенного тетрапептида (II) получают реакцией с дипентафторфенилкарбонатом в ДМФА в присутствии N-метилморфолина. Пентапептид, ацетилированный по серину (III), получают гидрированием над Pd-чернью защищенного пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)2 в присутствии уксусной и/или муравьиной кислоты. Структура пентапетида подтверждена данными масс- и ЯМР-спектроскопии.

Пентапептид III растворяют в ДМФА, добавляют N-метилморфолин и образовавшуюся N-метилморофолиновую соль пентапептида конденсируют с пентафторфениловым эфиром Boc-защищенного тетрапетида в течение 16-47 ч, после чего растворитель упаривают. Полученный защищенный нонапептид деблокируют в муравьиной кислоте, а затем снимают ацетильную или формильную группу в щелочных условиях с использованием 0,1 - 2 М раствора NH4OH, NaOH или любого другого подходящего щелочного агента. Очистку пептида δ-сна проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе.

Чистота полученного по заявляемой схеме пептида δ-сна подтверждена данными ЯМР-1H-спектроскопии и ВЖХ на обращенной фазе.

Для ТСХ используют пластинки с силикагелем фирмы Merck N 5724 и хроматографические системы, указанные в табл. 1.

Обнаружение веществ проводят путем последовательной обработки пластинок хлором, а затем 2% водным раствором крахмала, содержащим 1% NaI и 0,1% NaN3. Упаривание растворов проводят на роторном испарителе при 30-40oC.

В табл. 2 приведены физико-химические характеристики целевого продукта и промежуточных пептидов, т.к. все промежуточные соединения являются новыми.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. BocTrpAlaGlyGly (IV).

14,2 г (0,05 моль) HBr•AlaGlyGly растворяют в 140 мл воды, добавляют 4,2 г (0,05 моль) NaHCO3, а затем - 28,2 г (0,06 моль) BocTrpOPfp в 200 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение 12 ч. Растворители упаривают досуха, полученное масло растворяют в 100 мл этилацетата, промывают 2 • 100 мл 10% раствора лимонной кислоты, затем - 2 • 100 мл 10% раствора NaCl, этилацетатный слой высушивают над Na2SO4 и упаривают. Получают 22,8 г (93%) пептида IV.

Пример 2. BocTrpAlaGlyGlyOPfp (II).

К 20 г (0,041 моль) пептида IV в 100 мл ДМФА добавляют 17,7 г (0,045 моль) дипентафторфенилкарбоната и 4,5 мл (0,041 моль) N-метилморфолина. Смесь перемешивают 12 ч, упаривают досуха и перекристаллизовывают из этилацетата. Получают 26,4 г (98%) пептида II.

Пример 3. AspAlaSer(Ac)GlyGlu (IIIa).

46,9 г (0,05 моль) пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)2 растворяют в смеси 500 мл уксусной и 50 мл муравьиной кислот. Добавляют 5 г 10% Pd-черни и гидрируют 80 ч. Смесь упаривают досуха, полученное масло обрабатывают этилацетатом. Получают 30,7 г (97%) пептида IIIa с небольшой примесью пептида IIIb.

Пример 4. AspAlaSer(Form)GlyGlu (IIIb).

К 46,9 г (0,05 моль) пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)2 добавляют 500 мл муравьиной кислоты и гидрируют в течение 60 ч над 5 г Pd-черни. По завершении гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, полученное масло обрабатывают этилацетатом и получают 26,5 г (98%) пептида IIIb.

Пример 5. CF3COOH • AspAlaSer(Form) GlyGlu.

К 46,9 г (0,05 моль) пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)2 добавляют 500 мл муравьиной кислоты и гидрируют в течение 80 ч над 5 г Pd-черни. По завершении гидрирования катализатор отфильтровывают, к фильтрату добавляют 50 мл трифторуксусной кислоты и упаривают досуха. Полученное масло обрабатывают этилацетатом и получают 26,5 г (98%) трифторацетата пентапептида IIIb.

Пример 6. BocTrpAlaGlyGlyAspAlaSer(Form) GlyGlu (Vb).

2,37 г (3,6 ммоль) пептида II растворяют в 40 мл абс. ДМФА, добавляют 1,66 г (3 ммоль) пептапептида IIIb и 1,32 мл (12 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 18 ч, упаривают досуха и полученное масло обрабатывают 100 мл смеси этилацетат : уксусная кислота 10 : 1. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл этилацетата, затем - 50 мл диэтилового эфира и высушивают в вакууме. Получают 3,69 (95%) нонапептида Vb, гомогенного по ТСХ. Аналогично получают соединение Va с выходом 92%.

Пример 7. TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu (I).

К 2,59 г (2 ммоль) пептида Vb добавляют 40 мл муравьиной кислоты и оставляют на 24 ч при 0 - 4oC. Реакционную смесь упаривают досуха, к образовавшемуся пептиду добавляют 20 мл 5% аммиака и оставляют при 4oC на 10 ч. Затем пептид лиофилизуют и хроматографируют на ДЕАЕ-сефадексе А-25 в ацетатной форме в 0,3 М ацетате аммония. Фракции, содержащие пептид δ-сна, лиофилизиуют и получают 1,60 г (1,84 ммоль, 90%) пептида I.

Аналогично получают пептид I, исходя из нонапептида Va, с выходом 90%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать с большим выходом пептид δ-сна высокой степени чистоты.

Похожие патенты RU2111972C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА δ- СНА 1995
  • Безруков М.В.
  • Панченко А.Е.
RU2111215C1
ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ РЕГЕНЕРАТИВНО-РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 1994
  • Оноприенко Л.В.
  • Михалева И.И.
  • Войтенков Б.О.
  • Иванов В.Т.
  • Окулов В.Б.
RU2065445C1
ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИСТРЕССОРНЫМ, ПРОТИВОСУДОРОЖНЫМ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 1997
  • Михалева И.И.
  • Прудченко И.А.
  • Менджерицкий А.М.
  • Вилков Г.А.
RU2115660C1
ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ ЯЩУРА ШТАММА A 1992
  • Яров А.В.
  • Суровой А.Ю.
  • Чепуркин А.В.
  • Волкова Т.Д.
  • Вольпина О.М.
RU2043363C1
Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH 2021
  • Балаев Александр Николаевич
  • Осипов Василий Николаевич
  • Охманович Кирилл Анатольевич
  • Чуев Владимир Петрович
  • Бузов Андрей Анатольевич
  • Симаков Сергей Вадимович
RU2767030C1
ФУЛЛЕРЕНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ГЛИКОПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕЕ АДЪЮВАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1997
  • Жмак М.Н.
  • Вольпина О.М.
  • Куприянова М.А.
  • Андронова Т.М.
  • Макаров Е.А.
  • Романова В.С.
  • Парнес З.Н.
  • Вольпин М.Е.
  • Иванов В.Т.
RU2124022C1
ГЕПТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СВОЙСТВАМИ ПСИХОСТИМУЛЯТОРА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ С ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬ 1983
  • Пономарева-Степная М.А.
  • Незавибатько В.Н.
  • Потаман В.Н.
  • Вальдман А.В.
  • Козловская М.М.
  • Вальдман Е.А.
  • Бондаренко Н.А.
RU1124544C
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛОГОВ АДЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА (АКТГ), ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (4-10), ОБЛАДАЮЩИХ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ТЕТРАПЕПТИД ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2006
  • Азьмуко Андрей Андреевич
  • Балдин Михаил Иванович
  • Беспалова Жанна Дмитриевна
  • Молокоедов Александр Сергеевич
  • Невзорова Надежда Владимировна
  • Сидорова Мария Владимировна
  • Овчинников Михаил Владимирович
  • Фрид Дмитрий Александрович
RU2315057C2
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИПСИХОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2008
  • Андреева Людмила Александровна
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Зозуля Андрей Александрович
  • Кост Наталия Всеволодовна
  • Мешавкин Виктор Константинович
  • Воронина Татьяна Александровна
  • Гарибова Таисия Леоновна
  • Середенин Сергей Борисович
RU2411248C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ АМИНОВ 1998
  • Кубракова И.В.
  • Формановский А.А.
  • Михура И.В.
RU2148055C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 111 972 C1

Реферат патента 1998 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА δ СНА

Использование: в медицинской химии при получении пептипов, обладающих широким спектром физиологической активности. Сущность изобретения: усовершенствованный способ получения пептида δ-сна: Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu (I), включающий конденсацию пентафторфенилового эфира Boc-защищенного тетрапептида BocTrpAlaGlyGlyOPfp (II) с пентапептидом AspAlaSer(X)GlyGlu (III), где X - ацетил или формил, в диметилформамиде в присутствии N-метилморфолина, удаление Boc-группы муравьиной кислотой при температуре от -2 до +8oC, снятие ацетильной или формильной группы в щелочных условиях и хроматографическую очистку целевого продукта; гомогенный по данным ТСХ пептид δ-сна получают с выходом 65 - 80%. 2 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 111 972 C1

Способ получения пептида δ-сна формулы
Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu,
включающий конденсацию Nα-защищенного C-активированного тетрапептида Trp-Ala-Gly-Gly с пентапептидом Asp-Ala-Ser-Gly-Glu с последующим снятием защитных групп и хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что пентафторфениловый эфир Вос-защищенного тетрапептида формулы
Boc-Trp-Ala-Gly-Gly OPfp
конденсируют с пентапептидом формулы

где X - ацетил или формил,
в диметилформамиде в присутствии N-метилморфолина, удаление Вос-группы осуществляют с помощью муравьиной кислоты при температуре -2 ... +8oC, а снятие ацетильной или формильной группы - в щелочных условиях.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2111972C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Ulyaninsky L.S
et.al
Kosm Biol
Aviakosm.Med
Способ приготовления консистентных мазей 1919
  • Вознесенский Н.Н.
SU1990A1
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб 1921
  • Игнатенко Ф.Я.
  • Смирнов Е.П.
SU23A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Burov Y.V
et.al., Bull
Exp
Biol
Med
Гребенчатая передача 1916
  • Михайлов Г.М.
SU1983A1
Устройство для избирательного вызова телефонных аппаратов 1923
  • Виненный И.В.
SU1240A1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Sukmkh G.T
et.al, Dokl
Biol
SSSR, 1985, v.278, p
ПРИБОР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ПРОХОДЯЩЕГО ПАРА В ТРУБАХ И НАГРУЗОК ПАРОВЫХ КОТЛОВ 1921
  • Попов Н.В.
SU595A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Саргоян А.С
и др
Биоорганическая химия, 1981, т.7, с.1125-48
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Шредер З., Любке К
Пептиды, М.: Мир, 1967, с.200 - 280
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1
Bodanszky M., Principles of peptide sunthesis 1984, Springer Verlag, p.220
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов 1921
  • Ланговой С.П.
  • Рейзнек А.Р.
SU7A1
Калихевич В.Н
и др
ЖОХ, 1981, т
Способ запрессовки не выдержавших гидравлической пробы отливок 1923
  • Лучинский Д.Д.
SU51A1
Прибор для заливки свинцом стыковых рельсовых зазоров 1925
  • Казанкин И.А.
SU1964A1
Топка с несколькими решетками для твердого топлива 1918
  • Арбатский И.В.
SU8A1
Bodansky M
et.al., J
Org
cheu
Сплав для отливки колец для сальниковых набивок 1922
  • Баранов А.В.
SU1975A1
Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1
Stewart J.M
et.al., Solig Phase Peptide Synthesis, 1989, Pierce cheuical Company, P
Способ использования делительного аппарата ровничных (чесальных) машин, предназначенных для мериносовой шерсти, с целью переработки на них грубых шерстей 1921
  • Меньщиков В.Е.
SU18A1
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами 1921
  • Богач В.И.
SU10A1
Пептиды
Основные методы образования пептидных связей
/Под ред
Гросс Э., Майенхофер И
- М.: Мир, 1983, с
Катодное реле 1918
  • Чернышев А.А.
SU159A1

RU 2 111 972 C1

Авторы

Безруков М.В.

Панченко А.Е.

Прудченко И.А.

Михалева И.И.

Иванов В.Т.

Даты

1998-05-27Публикация

1995-04-07Подача