СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММА-ГЛОБУЛИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭПИЗООТИЧЕСКОГО ЛИМФАНГОИТА ЛОШАДЕЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/16 

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии и касается способа получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей (ЭЛЛ).

ЭЛЛ (синонимы - африканский сап, японская кожная язва, псевдосап, эпизоотическое воспаление лимфатических сосудов, бластомикоз, гистоплазмоз, пантушко) - контагиозное хроническое заболевание однокопытных животных, характеризующееся поражением (воспалением) лимфатических сосудов кожи, лимфатических узлов и подкожной клетчатки, слизистых оболочек с образованием язв и абсцессов, кератитов и пневмонии.

Возбудитель заболевания - дрожжевидный грибок Histoplasma farciminosus (синоним - Cryptococcus farciminosus) впервые описан в 1873 г. итальянским ученым Ривольта (Rivolta). Заболевание наиболее широко было распространено в Африке и Азии, зарегистрировано также в различных европейских странах, в том числе в России в ходе первой и второй мировых войн, что связано с контактом животных из различных по эпизоотической ситуации стран, частыми перемещениями больных лошадей, невыполнением необходимых ветеринарно-санитарных мероприятий.

Основным источником заражения является больное животное. Однако инфицированные почва и предметы ухода также могут стать причиной заражения. В организм животного гриб проникает через поврежденные участки кожного покрова и локализуется в лимфатических сосудах, подкожной клетчатке и собственно коже. Клиническое проявление ЭЛЛ характеризуется появлением язв на коже, воспалением лимфатических сосудов и образованием узелков. Степень поражения зависит от вирулентности возбудителя и уровня защитных сил организма. В СССР для лечения ЭЛЛ успешно испытаны различные препараты: формалин, скипидар, новарсенол, ихтиол, кристаллвиолет, йод и многие другие. Наряду с местным лечением при слабой степени поражения применяют хирургическое лечение и внутривенное введение 4%-ного водного раствора формалина и хлористой ртути в концентрации 1 : 1000. Для профилактики ЭЛЛ проводили диагностические и ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на выявление больных животных, своевременное лечение заболевших животных, тщательную дезинфекцию предметов ухода и неблагополучных помещений. Большая работа, проведенная в нашей стране ветеринарными специалистами, способствовала тому, что ЭЛЛ в СССР был ликвидирован. Однако в настоящее время существует угроза его появления в южных регионах России, что вызвало необходимость поиска и разработки средств специфической профилактики ЭЛЛ, которые до сих пор не получены [1].

Известен способ лечения лошадей, больных ЭЛЛ, путем подкожного введения в область верхней трети шеи 100 мл крови других лошадей, страдающих той же болезнью, и обработки пораженных участков медным купоросом [2].

Недостатки данного способа состоят в том, что для лечения используют кровь больных животных, которая может содержать возбудитель болезни, что в значительной степени снижает ценность предложения.

Решений, аналогичных предлагаемому изобретению, в доступных источниках информации не обнаружено.

Задачей создания изобретения является разработка способа получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ. Технический результат от использования изобретения заключается в обеспечении безопасности и высокой активности препарата.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: способ получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ из биологической жидкости; в качестве биологической жидкости используют гипериммунную сыворотку крови животных-продуцентов; в качестве животных-продуцентов используют крупный рогатый скот (КРС); КРС используют в возрасте 1,2 - 2,0 лет массой 250 - 280 кг; КРС подвергают предварительной многократной гипериммунизации возбудителем болезни в среднюю треть шеи в два цикла с интервалом в 29 - 31 день; во время первого цикла КРС гипериммунизируют в течение 3 - 4 дней в дозе по 3 - 5 мл однократно; во время второго цикла - в течение 2 - 3 дней в дозе 7 - 9 мл однократно; через 4 - 6 дней после окончания гипериммунизации КРС подвергают обескровливанию; из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку; pH гипериммунной сыворотки устанавливают в пределах 6,9 - 7,2; в гипериммунную сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%; после двухчасовой экспозиции гипериммунную сыворотку подвергают центрифугированию при 2500 об/мин в течение 30 мин для выделения гамма-глобулина; гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата.

Изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата, во всех случаях, на которые испрашивается объем правовой охраны: способ получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ из биологической жидкости; в качестве биологической жидкости используют гипериммунную сыворотку крови животных - продуцентов; в качестве животных-продуцентов используют КРС; КРС подвергают предварительной многократной гипериммунизации возбудителем болезни в два цикла с интервалом в 29 - 31 день; во время первого цикла КРС гипериммунизируют в течение 3 - 4 дней в дозе по 3 - 5 мл однократно; во время второго цикла - в течение 2 - 3 дней в дозе по 7 - 9 мл однократно; через 4 - 6 дней после окончания гипериммунизации КРС подвергают обескровливанию; из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку; pH гипериммунной сыворотки устанавливают в пределах 6,9 - 7,2; в гипериммунную сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%; после двухчасовой экспозиции гипериммунную сыворотку подвергают центрифугированию для выделения гамма-глобулина.

Достижение технического результата предлагаемого способа можно объяснить следующим образом.

Использование гипериммунной сыворотки крови в качестве биологической жидкости и КРС в качестве животных-продуцентов данной сыворотки обеспечивают безопасность применения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ, так как КРС не подвержен этому заболеванию.

Предлагаемая схема гипериммунизации КРС позволяет получить высокий титр антител в крови животных.

Обработка гипериммунной сыворотки крови КРС полиэтиленгликолем при pH 6,9 - 7,2 с последующим центрифугированием позволяет произвести полное избирательное выделение гамма-глобулина высокой степени чистоты и активности.

Полученный гамма-глобулин содержит высокий титр высокоочищенных антител, вступающих во взаимодействие с возбудителем и нейтрализующих его, что препятствует дальнейшему размножению криптококка в организме животных. Применение гамма-глобулина, полученного предлагаемым способом на больных эпизоотическим лимфангоитом лошадях обеспечивает их выздоровление в 85 - 90% случаях через 30 - 40 дней.

Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения: КРС используют в возрасте 1,5 - 2 лет массой 250 - 280 кг; для выделения гамма-глобулина гипериммунную сыворотку центрифугируют при 2500 об/мин в течение 25 - 35 мин; полученный гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении.

При исследовании совокупности существенных признаков, характеризующих предлагаемый способ, не выявлено каких-либо аналогичных известных решений, касающихся способов получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и отсутствие источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, свидетельствуют о том, что изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления в них признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. Результаты поиска показали, что, предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявляемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата, изложенных в п. 19.5.3 Правил составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Пример 1. Для получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ используют в качестве биологической жидкости гипериммунную сыворотку крови животных-продуцентов, в качестве которых используют КРС в возрасте 1,5 - 2 лет массой 250 - 280 кг. Для гипериммунизации КРС используют в качестве антигена водную суспензию микроконидий гриба эпизоотического штамма Cryptococcus farciminosus Rivolta с концентрацией 50 млн/мл. Гипериммунизацию животных возбудителем болезни осуществляют подкожно в среднюю треть шеи в два цикла с интервалом в 30 дней. Во время первого цикла антиген вводят животным в течение 3 дней однократно в дозе по 4 мл, включающей 1 мл водной суспензии гриба, 1 мл физиологического раствора и 2 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 30 дней проводят второй цикл гипериммунизации КРС. Во время второго цикла антиген вводят животным также подкожно в среднюю треть шеи в течение 2 дней однократно в дозе по 8 мл, включающей 2 мл водной суспензии гриба, 2 мл физиологического раствора и 4 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 5 дней после завершения второго цикла гипериммунизации животных подвергают обескровливанию. От одной головы КРС получают - 12 л крови, из которой можно приготовить ≈250 доз гамма-глобулина. Из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку. pH сыворотки снижают до 6,9 - 7,2. Затем в нее добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%. Сыворотку перемешивают и после двухчасовой экспозиции при 10^oC ее подвергают центрифугированию на центрифуге Mistral 6 L при 2500 об/мин в течение 30 мин для отделения осадка, содержащего гамма-глобулин. Полученный гамма-глобулин имеет пастообразную консистенцию желтовато-коричневого цвета. Гамма-глобулин ресуспендируют в физиологическом растворе в 1/50 исходного объема. Полученный гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении. Перед высушиванием в каждую ампулу помещают 4 мл концентрата гамма-глобулина. Активность полученного препарата в РДП составляет 1 : 64, в ИФА - 1 : 64000. Содержание белка в препарате определяют методом Лоури и его количество составляет ≈30 мг/мл. Перед использованием сухой гамма-глобулин разводят в 10 мл физиологического раствора. Больным лошадям вводят по 10 мл гамма-глобулина двукратно через день подкожно в область нижней трети шеи.

Пример 2. Проверку лечебно-профилактичских свойств гамма-глобулина против ЭЛЛ на лабораторных животных (мышах) осуществляли следующим образом.

Для опыта были приготовлены живые микроконидии гриба криптококка с концентрацией 20 млн/мл и лиофилизированный гамма-глобулин с активностью в ИФА 1 : 1000, полученный так, как описано в примере 1. Для определения лечебно-профилактических свойств гамма-глобулина в опыт взяли 35 мышей, которым ввели живые микроконидии криптококка в дозе 0,1 мл с концентрацией 20 млн/мл. Через 14 дней 10 контрольных мышей декапитировали и из тканей легких сделали высевы на косяки с КДА. Остальным мышам, разделенным на две группы, ввели гамма-глубулин в дозе 0,1 мл и 0,2 мл (по 0,1 мл через день). После 7 суток инкубации мышей декапитировали, сделали высевы на КДА с тканей легкого мышей. Наблюдение с момента высева вели в течение 15 дней. Оценку свойств гамма-глобулина проводили по проценту занимаемой площади выросших колоний криптококка. Результаты опыта приведены в таблице.

Согласно результатам, приведенным в таблице, видно, что однократное введение гамма-глобулина оказывает положительный лечебный эффект в 89% случаях, двукратное - в 93% случаях. При этом необходимо отметить, что количество зараженных мышей снизилось с 90% (контроль) до 50%.

Таким образом, можно заключить, что гамма-глобулин КРС обладает лечебным действием против ЭЛЛ, причем двукратное введение препарата дает лучшие результаты.

Пример 3. Проверку лечебно-профилактических свойств гамма-глобулина против ЭЛЛ на больных животных осуществляли следующим образом. Гамма-глобулин приготовили так, как описано в примере 1.

В опыт взяли 12 больных лошадей, ранее не подвергавшихся медикаментозному лечению. Четыре лошади находились в ранней стадии заболевания, семь - в средней степени тяжести и одна - в тяжелой форме заболевания. Лошадям в ранней и средней степени тяжести заболевания вводили гамма-глобулин в дозе по 10 мл двукратно через день в область нижней трети шеи. В последнем случае была применена двойная доза гамма-глобулина. Через трое суток после введения препарата наблюдали улучшение состояния первых двух групп животных. У них начался процесс заживления язв. Полное выздоровление животных указанных групп наступило через 40 дней. Несмотря на введение двойной дозы гамма-глобулина, лошадь с тяжелой формой заболевания пала.

Пример 4. Проверку лечебно-профилактических свойств гамма-глобулина против ЭЛЛ на больных лошадях осуществляли следующим образом. Гамма-глобулин приготовили так, как описано в примере 1.

В опыт взяли 12 лошадей, больных эпизоотическим лимфангоитом в различных стадиях заболевания и ранее не подвергавшихся лечению: 8 лошадей находились в ранней стадии заболевания, 2 лошади - в средней степени тяжести и 2 лошади - в тяжелой форме заболевания. Лошадям в ранней и средней тяжести заболевания вводили гамма-глобулин в дозе по 10 мл двукратно через день в область нижней трети шеи. В последнем случае была применена двойная доза гамма-глобулина. Через трое суток после введения препарата наблюдали улучшение состояния животных, находящихся в ранней и средней степени тяжести заболевания. У них начался процесс заживления язв. Полное выздоровление животных указанных групп наступило через 40 дней. Лошади с тяжелыми формами заболевания пали, несмотря на введение им двойных доз гамма-глобулина. Контрольная группа состояла из 15 лошадей, подвергавшихся лечению антибиотиками и фракцией АСД-2. Из них 9 лошадей, выявленных в начальной стадии заболевания, прошли курс лечения и считались выздоровевшими, остальные пали.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий:
- гамма-глобулин против ЭЛЛ, воплощающий предлагаемый способ при его осуществлении, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарии;
- гамма-глобулин, полученный предлагаемым способом, обладает высокими лечебно-профилактическими свойствами;
- для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов.

Следовательно, изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Петрович С.В. Эпизоотический лимфангоит. Микозы животных. / М., 1989, 79 - 82.

2. Лопатников Г. И. Опыт лечения лимфангоита лошадей // Ветеринария, 1954, 8, 32.

3. Наулайнен А.И. Терапия эпизоотическго лимфангоита лошадей сульфолетролом и моносептолом// Ветеринария, 1951, 9, 61.

4. Справочник. Инфекционные и инвазионные болезни лошадей. Эпизоотический лимфангоит. - М.: Колос, 1976, 209 - 219.

5. Баяхунов Я.К. Изыскание эффективного метода лечения и разработка комплекса мероприятий по ликвидации эпизоотического лимфангоита лошадей/ Тр. Алма-Атинского зооветинститута, 1955, 8, 177 - 188.

6. Хигелевский Б.Н. Эпизоотический лимфангоит. Ветеринарная энциклопедия, - М., 1976, 676 - 681.

Способ предназначен для использования в ветеринарной медицине и биотехнологии. Гамма-глобулин получают из сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) в возрасте 1,5 - 2 года массой 250 - 280 кг. Гипериммунизацию животных возбудителем болезни осуществляют в два цикла с интервалом в 30 дней. Во время первого цикла антиген вводят животным однократно в течение 3 дней в дозе по 4 мл, включающей 1 мл водной суспензии гриба (50 млн/мл), 1 мл физраствора и 2 мл 1%-ного раствора сапонина. Во время второго цикла антиген вводят животным также однократно в течение 2 дней в дозе по 8 мл, включающей 2 мл водной суспензии гриба, 2 мл раствора и 4 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 5 дней после окончания второго цикла гипериммунизации животных подвергают обескровливанию. Из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку, pH которой устанавливают в пределах 6,9 - 7,2. В сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20% и после двухчасовой экспозиции при 10^oC сыворотку подвергают центрифугированию при 2500 об/мин в течение 30 мин для выделения гамма-глобулина с последующей его лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении. Перед использованием сухой гамма-глобулин разводят в 10 мл физраствора. Больным лошадям вводят по 10 мл гамма-глобулин двукратно через день подкожно в область нижней трети шеи. Способ обеспечивает безопасность и высокую активность препарата. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей из биологической жидкости, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют гипериммунную сыворотку крови животных-продуцентов, а в качестве животных-продуцентов - крупный рогатый скот, который предварительно подвергают многократной гипериммунизации возбудителем болезни в два цикла с интервалом 29 - 31 день, при этом во время первого цикла крупный рогатый скот гипериммунизируют в течение 3 - 4 дней в дозе по 3 - 5 мл однократно, а во время второго цикла - в течение 2 - 3 дней в дозе по 7 - 9 мл однократно, через 4 - 6 дней после окончания гипериммунизации животных подвергают обескровливанию, из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку, pH которой устанавливают в пределах 6,9 - 7,2 и в нее добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%, после двухчасовой экспозиции гипериммунную сыворотку центрифугируют для выделения целевого продукта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что крупный рогатый скот используют в возрасте 1,5 - 2,0 года массой 250 - 280 кг. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения гамма-глобулина гипериммунную сыворотку центрифугируют при 2500 мин^-1 в течение 25 - 35 мин. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении.