Изобретение относится к области вирусологии, иммунологии и биотехнологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях моноклональные антитела (МАт) к вирусу везикулярной болезни свиней (ВБС) штамм Т-75, которые могут быть использованы для научных исследований и приготовления средств диагностики, профилактики и лечения ВБС.
ВБС - высококонтагиозная болезнь свиней всех возрастных групп, характеризующаяся острым течением, лихорадкой и поражением кожного покрова с образованием везикул на рыле, конечностях в области венчика, межкопытной щели и мякишей. Возбудитель-энтеровирус, относящийся к пикорновирусам. Установлено два серотипа вируса. В серологических реакциях обнаружено антигенное родство между вирусами везикулярной болезни и энтеровирусом человека - Коксаки В5. К вирусу чувствительны первично-трипсинизированные монослойные культуры почек свиней, мышей, а также перевиваемые линии клеток JBRS-2 и PK-15.
Впервые ВБС была зарегистрирована в Италии в 1966 г., когда при исследовании патматериала, взятого от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, выделили вирус, относящийся к роду энтеровирусов. С 1972 г. эта болезнь охватила ряд стран Европы, где регистрируется периодически.
Источник инфекции - больные свиньи. Болезнь может распространяться с продуктами убоя таких свиней, необеззараженными отходами животного происхождения, инфицированными вирусом объектами внешней среды (помещения, предметы ухода, транспорт и т.д.). Считается, что во время перелета скворцов и усиленной миграции диких свиней возможно увеличение заболеваемости домашних свиней. Болезнь характеризуется меньшей контагиозностью и распространяется медленнее, чем ящур, с охватом меньшего количества животных. В неблагополучных хозяйствах с низкой санитарной культурой может поражаться 100% восприимчивых свиней, причем у 5-6% из них отмечают осложнения на конечности, которые проявляются отторжением рогового башмака. Продолжительность болезни 7-10 сут. Течение более доброкачественное, чем при ящуре.
Постановка диагноза и дифференциальная диагностика осуществляются по эпизоотическим, клиническим и патологоанатомическим данным. Однако ВБС трудно отличить от ящура, везикулярного стоматита и везикулярной экзантемы свиней. Поэтому для исключения указанных болезней и постановки правильного диагноза необходимо исследовать патматериал от больных животных в серологических и иммунохимических реакциях со специально приготовленными антительными и антигенными реагентами. При отсутствии патматериала нужного качества проводят вирусологическое исследование заражением чувствительных культур клеток с последующей постановкой указанных реакций [1].
В связи с тем, что заболевание является опасной для свиноводства вирусной инфекцией, это вынуждает интенсифицировать работу по созданию более эффективных средств диагностики и профилактики ВБС. Для выявления и идентификации вируса ВБС и противовирусных антител наиболее перспективным является иммуноферментный анализ с применением МАт, которые широко используют зарубежные исследователи [2].
МАт - это наиболее эффективный инструмент для изучения закономерностей взаимодействия вируса и клетки, выявления патологических и функциональных характеристик и биологических свойств возбудителя. С помощью МАт можно изучить антигенное родство штаммов вируса ВБС, а также провести идентификацию возбудителей заболеваний, протекающих с везикулярным синдромом (везикулярная экзантема свиней, везикулярный стоматит, ящур).
МАт имеют ряд преимуществ перед традиционно применяемыми поликлональными антителами. Они характеризуются химической гомогенностью, строго определенной специфичностью к антигенным детерминантам вируса. Источники их получения (гибридомы) отличаются генетической стабильностью и могут длительное время сохраняться в жидком азоте. МАт могут быть наработаны в любых количествах в виде асцитической жидкости мышей или супернатантов культуры клеток.
Для диагностики и идентификации болезней, протекающих с везикулярным синдромом, широко применяется иммуноферментный анализ с использованием МАт.
Известны штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующих МАт к вирусу ящура шести типов A, O, C, Азия-1, САТ-1 и САТ-2 [3 - 7] и к вирусу везикулярного стоматита [8 - 11].
В настоящее время известен также штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих МАт к вирусу ВБС, штамм O-72 [12].
В этой работе приведены данные о получении 10 позитивных клонов гибридных клеток мышей, продуцирующих моноклональные антитела на цельный вирус ВБС, штамм O-72. Титр антител в супернатантах этих клонов по данным ИФА составил 1: 10 - 1:100. Специфическая активность асцитной жидкости была на 3-4 порядка выше по сравнению с супернатантами. С гетерологичными антигенами супернатанты и асцитные жидкости перекрестно не реагировали.
В России штамм вируса Т-75 вируса ВБС является производственным и используется при изготовлении вакцины и диагностических препаратов [13].
Однако в доступных нам источниках информации мы не обнаружили сведений о получении МАт к штамму Т-75 вируса ВБС.
В задачу создания изобретения входило получение штамма гибридных культивируемых клеток (гибридом), продуцирующих МАт к штамму Т-75 вируса ВБС высокоактивных в иммуноферментном анализе и реакции нейтрализации с гомологичным вирусом.
Поставленная задача решена тем, что получен новый, ранее неизвестный штамм гибридных культивируемых клеток мыши (Mus musculus L.) VBS N 1-96, продуцирующий МАт к вирусу везикулярной болезни свиней, штамм Т-75. Культура хранится в музее ВНИИ защиты животных на 6-10 пассажах в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии BALB/c, депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК(П)647Д.
Характеристика полученного штамма 1.
Родословная штамма.
Гибридный штамм VBS-96 получен слиянием мышиных миеломных клеток линии PAI с клетками селезенки мыши линии BALB/c, предварительно иммунизированный вирусом ВБС штамм Т-75.
2. Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования.
Клетки заморожены на 6-10 пассажах в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии BALB/c.
3. Стандартные условия выращивания.
Температура культивирования +37oC. Среда культивирования DMEM с добавлением 15% сыворотки эмбрионов коров, 50 мкг/мл гентамицина, pH 7,0-7,2.
4. Культуральные свойства.
Штамм растет на средах для культур клеток млекопитающих IMDM, DMEM, RPMI-1640 с добавлением 10-20% фетальной сыворотки КРС с 50 мкг/мл гентамицина. При селекции гибридных клеток в питательную среду добавляют гипоксантин-аминоптерин-тимидин (ГАТ) в рабочих разведениях. Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл. Оптимальная pH среды 7,0-7,2, клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37oC. При посеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой. При посевной дозе 150000 кл/мл сплошной монослой формируется на 2-3 день. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью. Легко снимаются со стенок посуды встряхиванием без применения трипсина и версена. Жизнеспособность клеток поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева - 3 раза в неделю.
Кратность рассева составляет 1:2 - 1:5.
Тип роста - станционарная суспензия. При введении гибридом внутрибрюшинно у мышей линии BALB/c образуется асцитная или твердая опухоль. Перед введением клеток за 5-20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл минерального масла (ТУ-38-101-884-84). Титр антител в асцитической жидкости в ИФА составляет 10-3-10-5. От одной мыши получают 3-10 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней.
5. Характеристика культивирования гибридомы в организме животного.
Образует асцитические опухоли на мышах BALB/c. Доза клеток при перевивке 4-10 млн/мл мышам, праймированным 0,3-0,5 мл минерального масла (ТУ-38-101-884-84) за 5-20 дней до введения клеток. Срок образования асцита через 10-20 дней, не теряет антителопродуцирующей способности при перевивке в течение 6-10 пассажей на мышах (срок наблюдения).
6. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика.
Кариотип соответствует виду (мышиный). Модальный класс - 84 хромосомы. Модальный класс для родительской миеломной линии PAI-64 хромосомы.
7. Цитоморфологическая характеристика.
Клетки круглые, различной величины. Ядра занимают большую часть клетки.
8. Онкогенность.
Штамм обладает онкогенными свойствами, характеризующимися образованием асцитов или твердых опухолей у мышей линии BALB/c.
9. Маркерные характеристики.
Изоферменты ЛДГ соответствуют мышиным (одна изоформа с дополнительной полосой). Гибридные клетки продуцируют МАт к вирусу ВБС штамм Т-75.
10. Данные о контаминации.
Микробиологическим, цитохимическим (окраска оливомицином, акридиновым оранжевым) и электронно-микроскопическим методами контаминанты не обнаружены.
11. Биотехнологическая характеристика.
Штамм продуцирует МАт, относящиеся к классу IgG и обладающие специфической активностью в ИФА и РН на культуре клеток ПГСК, обнаруживаются в асцитической жидкости в ИФА на протяжении 6-10 пассажей на мышах (срок наблюдения) в разведениях 10-3-10-5 и обладают специфической активностью к вирусу ВБС, штамм Т-75. Активность в РН - 6,5 лог2. Культуральную жидкость можно применять в качестве диагностического антительного препарата, однако для получения более высокого титра антител до 105 гибридные клетки в дозе 1-10 млн/0,5 мл вводят внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, праймированным мышам внутрибрюшинно минеральные масла. Через 14-20 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3-10 мл), клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит МАт. Осадок, содержащий гибридные клетки, вновь вводят мышам. Для повышения активности и специфичности МАт проводят их концентрирование и очистку, выделяя чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем трехкратного осаждения полунасыщенным раствором сульфата аммония и центрифугируют при 3500 об/мин в течение 30 мин.
Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР) с последующим диализом против этого же буфера при +4oC 24-48 часов. Культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, а асциты - 20-30 мг/мл специфических иммуноглобулинов.
12. Способ криоконсервирования.
Гибридомные клетки консервируют в жидком азоте в пластиковых или стеклянных ампулах в объеме 1 мл с концентрацией 4-10 млн/мл. Криозащитная среда: ДМЕМ-50%, фетальная сыворотка КРС-43%, диметилсульфоксид-7%. Выживаемость клеток после хранения 60-90%. Размораживание проводят при 38oC в течение 70 секунд. Ампулы с клетками центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин и переносят во флакон. Выращивание на среде ДМЕМ с 15-20% фетальной сыворотки и ГАТ и высевают в стеклянный матрас объемом 50 см3. Клетки инкубируют при температуре 37oC. Когда колонии заполнят 50-70% площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к вирусу ВБС в ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.
Предложенный штамм гибридных культивируемых клеток получен по ранее разработанной методике [14] следующим образом.
Мышам линии BALB/c в возрасте 1,5-2 месяцев вводили интраперитонеально вирус ВБС штамм Т-75 в количестве 100 мкг/мышь в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Через 21 день проводили гипериммунизацию мышей интраперитонеально этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь без адъюванта. Спустя три дня после повторного введения антигена проводили тестирование сыворотки крови мышей на наличие специфических антител в ИФА. В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови не менее 103.
Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку, гомогенизировали ее и клетки ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМЕМ без сыворотки. Клетки миеломы линии PAI в логарифмической фазе роста отмывали в среде ДМЕМ от сыворотки и смешивали с иммунными клетками селезенки в соотношении 1: 1 - 1:5 и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 10 минут. К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50% раствор ПЭГ с м.м. 4000, содержащий 5% ДМCO. Клетки оставляли на 5 минут с ПЭГ. Затем по каплям в течение минуты добавляли 5 мл среды ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт еще на 5 минут. Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ, содержащей 20% фетальной сыворотки и ГАТ, в количестве 13,6 мг/л, 0,176 мг/л и 3,78 мг/л соответственно в рабочих концентрациях. Клетки вносили в 96-24-луночные пластины фирмы "Costar" (США) по 0,2-1,0 мл с концентрацией 100-20 тыс/лунка соответственно. Через 10-14 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА.
Позитивные клоны составляли от 5-50% от общего количества клонов. Эти клоны дважды субклонировали методом предельных разведений. Стабильный клон с наивысшим титром антител (МАт-3Д1) заложили на хранение в банк клеток (ВНИИЗЖ) под авторским названием VBS N 1-96 и депонировали во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК (П) 647Д.
Пример 1. Антиген ВБС штамм Т-75 идентифицируют в ИФА с помощью МАт. Для этого МАт, разведенные в 0,02-молярном карбонатно- бикарбонатном буфере pH 9,5 в количестве 100 мкл/лунка в концентрации 1-10 нг/лунка, вносят в лунки пластин из полистирола для ИФА и инкубируют в течение 12-14 часов при температуре 4o или 20oC. После сорбции избыток антител удаляют и 3-5 раз промывают лунки ФБР с 0,05% Твин-20. Затем в лунки вносят по 100 мкл испытуемого антигена в ФБР с 10% фетальной сыворотки КРС. Антиген готовят путем пяти- или десятикратных разведений в этом же растворе. Антиген инкубирут в лунках планшета 2 часа при 37oC, а затем 3-5 раз отмывают в ФБР. После этого в лунки вносят конъюгат (МАт, меченые пероксидазой хрена) в рабочем разведении. Конъюгат на ФБР с 10% фетальной сыворотки КРС до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете на IgG и инкубируют 1-2 часа при комнатной температуре. Затем лунки 3-5 раз промывают ФБР и в них вносят субстрат, содержащий орто-фенилендиамин 0,4 мг/мл в 0,1М цитрат-фосфатном буфере pH 5,0 и 0,01% перекиси водорода. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-5 минут проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 12-канальном спектрофотометре фирмы "Dynateck". Реакцию можно учитывать и визуально по интенсивности окраски оранжевого цвета. Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культуральным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА и РН.
Активность и специфичность МАт к вирусу ВБС определяется в ИФА и РН как с гетерологичными антигенами (вирус ящура A22 N 550, O1 N 194 и ВЭС), так и с гомологичным антигеном (ВБС штамм O-72).
Проведенные испытания показали, что МАт к вирусу ВБС штамм Т-75 не реагируют с возбудителями ящура, везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней штамм O-72.
Данные определения специфической активности культуральной жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма VBS N 1-96 регистрационный номер ВСКК(П)647Д, с гомо- и гетерологичными антигенами представлены в таблице.
Согласно данным, представленным в таблице, МАт клона 3Д1 имеют высокую специфическую активность с гомологичным антигеном ВБС штамм Т-75 и не активны с антигенами (ВБС штамм O-72, ВЭС штамм A-48 и C-72, ВЯ A22 N 550 и O1 N 194).
Пример 2. Титрование моноклональных антител к вирусу ВБС в реакции микронейтрализации на микропанелях.
Реакция микронейтрализации ставится против 100 ТЦД50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости, определяемые с помощью референтных сывороток, взятых от переболевших животных разных видов.
Схема постановки РН на 96-луночных микропанелях.
Во все лунки панели вносят по 5 мкл ростовой среды без сыворотки с антибиотиками по 50 мкл, моноклональных антител и 12-канальной пипеткой без смены наконечников перемешивают содержимое лунок и переносят по 50 мкл из ряда A до ряда H, т.е. делают двухкратные разведения. Из последнего ряда 50 мкл удаляют. Предварительно подготовленные разведения вируса вносят во все лунки, намеченные для данной дозы вируса, используя при этом 4-канальную пипетку. Доза вируса в 50 мкл.
Инкубируют при 37oC в течение часа в CO2 - атмосфере.
Во все лунки панели вносят суспензию клеток в ростовой среде в концентрации 0,5 - 1,0•106 кл/мл по 50 мкл.
Инкубируют при 37oC в течение 48 часов.
По истечении указанного времени панели просматривают под инвертированным микроскопом, регистрируя лунки с выраженным ЦПД и/или лунки со сформировавшимся монослоем.
Реакцию считают достоверной, если:
контроль дозы вируса показал, что в реакции использовали 32- 316 ТЦД50/50 мкл;
контроль культуры клеток показал наличие клеточного монослоя без признаков дегенерации;
в контроле среды и контроле ростовой среды отсутствуют признаки контаминации;
контроль токсичности тестируемых моноклональных антител показал отсутствие таковой, т.е. наличие плотного монослоя без признаков дегенерации.
Положительным считают титр сыворотки 1:16.
Полученные в соответствии с изобретением МАт, как химически чистые реагенты, могут применяться в ИФА и РН для обнаружения вируса ВБС штамм Т-75 и противовирусных антител в сыворотке крови восприимчивых сельскохозяйственных животных, а также при генно-инженерной и молекулярно-биологической характеристике возбудителя.
Кроме того, МАт против вируса ВБС могут быть весьма полезны в ветеринарной вирусологии в практических и чисто научных областях при:
идентификации полевых вирусных изолятов;
идентификации иммунологически важных антигенных сайтов на уровне аминокислотных последовательностей;
характеристике антигенных сайтов с использованием различных вариантов иммуноферментного анализа.
Использование МАт в ветеринарной практике при диагностике и профилактике заболевания сельскохозяйственных животных позволит оптимизировать диагностику и эпизоотическую ситуацию в стране по везикулярным болезням.
Источники информации:
1. Справочник ветеринарного врача, Н.М.Алтухов, В.И.Афанасьев, Б.А.Башкиров и др. ; Сост. А.А. Кунаков. - 2-е изд., перераб. и доп. - M.: Колос, 1996, 90-93.
2. Hedger R., Mann J. Swine vesicular disease virus. Virus Infections of Porcines. Amsterdam etc., 1989, 241-250.
3. Авт. св. СССР N 1565021 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент МАт к вирусу ящура O-1618", кл. C 12 N 5/00, 1987.
4. Авт. св. СССР N 1692146 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к 146 S компоненту вируса ящура O", кл. C 12 N 5/18, 1989.
5. Авт.св. СССР N 1692147 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител 146 S компоненту вируса ящура C1 N 564", кл. C 12 N 5/18, 1989.
6. Пат. СССР N 1751202 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к 146 S компоненту вируса ящура A5 (Алье)", кл. C 12 N 5/00, 1992.
7. Пат. России N 2012594 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к 146 S компоненту вируса ящура Азия-1, кл. C 12 N 5/00, 1991.
8. Pal R., Grinuell B., Snyder K., Wagner R. Regulation of viral transcription by the matrix protein of vesicular stomatitis virus probed by monoclonal antibodies and temperature - sensitive mutants. J.Virol., 1985, 56, 2, 386-394.
9. De Bishnu P., Tahara S., Banerjee A., Production and characterization of a monoclonal antibody to the protein vesicular stomatitis visus (Indiana serotype). J.Virol., 1982, 122, 2, 510-514.
10. Ohno S., Arnheiter H., Dubois-Dalcg M., Lazzarini R.lmmunocytochenucal localization of vesicular stomatitis virus proteins N and with monoclonal antibodies. J.Histochemistry, 1985, 82, 2, 185-196.
11. Vernon S., Webb P. Recent VSV infection detected by immunoglobulin M antibody capture ewzyme - linked immunosorbent assay. J.CIin.Microbiol, 1985, 2, 4, 582-586.
12. Фоменко В.Ю., Глобенко Л.А., Шажко Ж.А. Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела к возбудителям везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней. В мат.междунар.науч.конф. "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы". - Харьков, 1995, 529-531.
13. Инструкция по изготовлению и контролю гипериммунных сывороток и эталонных антигенов вируса везикулярной болезни свиней для реакции связывания комплемента, используемой в диагностических целях. Утверждена ГУВ ГАПК СССР 5 июля 1987 г.
14. Методика получения и поддержания гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к вирусу ящура Азия-1. Утверждена директором ВНИИЗЖ 22.06.94 г.
15. Методика выявления антител к вирусу ящура и везикулярных болезней в PH на микропанелях. Авторы: С.А.Дудников, С.Р.Кременчугская, И.Н.Селютина, С. Г.Баранов, Н.С.Дудникова. Утверждена директором института ВНИИЗЖ 31.01.96 г.
16. Tanda Т., Tokni Т., Ondere T. Induction of neitralising antibodies by structural proteins VP, and VP2 swine vesicular disease virus, Jan.Vet. Sci., 1987,49, 1, 129-132.
17. Ferris N., Powell H., Donaldson A. Use of precoated immunoplates and freere - dried reagents for the diagnosis of fooy and mouth disease and swine vesicular disease by enzime linked immunosorbent assay (ELISA). J.Virol. Methods, 1988, 19, 3-4, 197-206.
18. Ferris N. , Dawson M. Rontine application of enzyme - linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot - and mouth disease and swine vesicular diseases. J.Vet. Microbiol, 1988, 16, 3, 201-209.
19. Amstrong R. , Barnett l., An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and guantification of antibodies against swine Vesicular disease virus (SVDV)/ J.Virol.Metods, 1989, 25, 1, 71-80.
20. Williams P., Williamson K., Emerson S. Monoclonal antibodies to the N3 protein of VSV inhibit initiation of transcripts in vitro and dissociate leader RNA from m RNA synthesis.J.Virol., 1988, 167, 2, 342-348.
Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирует моноклональные антитела (МКА) к штамму Т-75, которые высокореактивны в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации с гомологичным вирусом. МКА относятся к изотипу IgG. Они обнаруживаются в асцитной жидкости в ИФА на протяжении 6 - 10 пассажей на мышах (срок наблюдения) в разведениях 10-3-10-5. МКА могут использоваться в ветеринарной практике для диагностики и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных. Полученный штамм обладает высокой продуктивностью моноклональных антител к штамму Т-75. 1 табл.
Штамм гибридных культивированных клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) 647 D - продуцент моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней штамм Т-75.
| Фоменко В.Ю., Глобенко Л.А | |||
| Шажко Ж.А | |||
| Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела к возбудителям везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней | |||
| Материалы научной конференции "Общая эпизоотология" | |||
| - Харьков, 1995, с.529-531. |
